Calcein AM/PI Double Stain Kit 活细胞/死细胞双染试剂盒

Calcein AM/PI Double Stain Kit 活细胞/死细胞双染试剂盒

产品信息

2）取5ul Calcein AM溶液(4 mM)和15ul PI溶液( 1.5 mM )加入5ml 1xAssay Buffer ,充分混匀。此时得到Calcein AM的工作液浓度为4uM , PI的工作液浓度为4.5uM。由于不同细胞系的zui佳染色条件不同,初次实验建议做梯度实验，以确定Calcein-AM和PI的zui适浓度。梯度筛选原则为使用zui低的探针浓度得到zui好的荧光结果。[注意:染色工作液必须现配现用,并且在当天用完。]
二、染色步骤

2.1 对于贴壁细胞， 先用细胞刮刀或者胰酶-EDTA消化细胞，之后离心机收集细胞(1000 rpm, 3min)。对丁悬浮细胞，直接离心(1000 rpm, 3min) 收集细胞。

2.2 去上清，用l x Assay Buffer充分清洗细胞2-3次。以充分去除残留的酯酶活性。

2.3 用l x Assay Buffer制备细胞悬液，使其密度为1x10⁵-1x10^6细胞/ml.

2.4 取100ul染色工作液加入200ul细胞悬液内，混匀，37C孵育15min

[注意:如果需要，可延长解育时间至30min.]

2.5 荧光显微镜下使用 490±10 mm激发滤片同时检测活细胞(黄绿色荧光)以及死细胞(红色荧光)。另外，使用545m的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。

[注意]可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的zui佳工作浓度。

a) 用0.1%皂素或者 0.1-0.5%地高辛孵育细胞10min,或者用70%乙醇孵育细跑30min.从而制备死细胞；

b) 用0.1-10uM的PI溶液进行死细胞染色。以得到仅仅对细胞核染色，而不会对细胞质染色的zui佳工作浓度；

c) 用0.1-10uM 的Calcein AM进行死细胞染色，以得到不会对细胞质染色的zui佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色，去观察是否活细胞能被染色。