菌落 PCR 分析克隆的重组体实验

溴化乙锭Taq 延伸 PCR 添加剂Tween2010% 溶液dNTP 溶液PCR 缓冲液热稳定 DNA 聚合酶引物

无菌枪头琼脂糖凝胶电泳设备和试剂

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

溴化乙锭

Taq 延伸 PCR 添加剂（Stratagene)

Tween20，10% 溶液

2. 酶和酶缓冲液

dNTP 溶液（包含所有的 4 种 dNTP，每种都是 25 mmol/L)

PCR 缓冲液，10X, 用户买热稳定聚合酶时公司一并提供，或者 PCR 优化缓冲液，比如，Opti-Prime PCR 优化试剂盒（Stratagene)，以及 PCR Optimizer(Invitrogen)

热稳定 DNA 聚合酶（5~10U)，比如，Taq DNA 聚合酶，克隆化的 Pfu DNA 聚合酶(Stratagene)

3. 核酸和寡核苷酸

可选择：插入物特异的引物（在双向克隆中用来确定插入物的方向）

一套筛选重组体的引物

4. 专用设备

用于划板和接菌的无菌枪头

用枪头代替牙签，是因为牙签可通过毛细作用带走液体，因此会改变反应混合物的浓度。

5. 額外项目

琼脂糖凝胶电泳设备和试剂，包括溴化乙锭

二、方法

1. 根据反应数目或要做的 PCR 反应的管数，在冰上用一个离心管像调鸡尾酒一样准备

PCR「鸡尾酒」式混合物，按如下顺序依次加入各种成分。

H₂O 将终体积补充到 25ul

Taq 缓冲液，10X                                                          2.5ul

Tween20(体积分数 10% 溶液）                                   1.0ul

dNTP 混合物（每种 dNTP 为 25 mmol/L)                     0.2ul

重组体筛选引物套（100ng/ul)                                     1ul

Taq 延伸 PCR 添加剂（5U/ul)                                     0.25ul

Taq DNA 聚合酶（5U/ul)                                              0.25ul

2. 在冰上，分装"鸡尾酒"式 PCR 混合物到每一个 PCR 试管中，每管移取 25ul。

3. 对照反应中，加入 1ul 的非重组 DNA。
可以选择：对于用来确定插入方向的反应，向恰当的反应管中加入第三个插入物特异的引物。

4. 对于重组筛选，用一个无菌枪头刺挑一下转化后长出的菌落，然后在相应的反应管中搅动菌落物质。在给每一个反应混合物接种后，迅速地移走枪头，并在含有***平板上轻涂以留菌种，以备后续分析。对于 PCR 介导的重组筛选，也可参考下面的疑难解答。

5. 轻轻混匀每个反应体系。

6. 用推荐的循环参数进行 PCR。

7. 用标准的琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物。推荐用 10~15 g/L 琼脂糖凝胶来优化分辨500~6000bp 的 PCR 产物。通常，取 1~5ul PCR 产物经溴化乙锭染色后分析。可以通过传统的瞬间成像技术或计算机图像软件来获取图像。