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一、 细胞和试剂的准备
1. 细胞样品：来源**细胞或外周血的白细胞。
2. 荧光标记单克隆抗体：常用的有FITC（fluorescein -isothiocyanate）和PE（phycoerythrin）标记的单克隆抗体。
3. 封闭抗体：抗Fc受体抗体
4. FACS缓冲液：
1×PBS 950 ml
FCS 40 ml
10%叠氮钠溶液 10 ml
5. 仪器缓冲液（FACS-flow）：仪器厂家提供
6. FACS清洁液（FACS clean ）和FACS洗净液（FACS rinse）：仪器厂家提供。
二、操作步骤
1. 单细胞悬液的制备：将1×105~1×107的细胞放入1.5 m l离心管中3000 r/min 离心5分钟，弃上清；加入FACS缓冲液100 μl 悬浮细胞。
2. 封闭细胞表面Fc受体：在步骤1中加入Fc受体抗体0.5 μl（0.5 mg/ml），水浴3分钟。
3. 细胞与荧光抗体结合：在步骤2中加入荧光抗体1 μl（0.5 mg/ml），水浴30分钟。
4. 洗细胞去除游离的荧光抗体：在步骤3中加入FACS缓冲液350 μl，轻轻混匀，3000 r/min，离心5分钟，弃上清，重复步骤（4）2次。
5. 上样前处理：取100 μl 仪器缓冲液加入步骤（4）获得的细胞沉淀中，轻轻混匀悬浮细胞，将细胞悬液移入FACS专用管中，准备进行仪器检测和分析。
三、仪器的操作
以FACSCaliburTM（BD Biosciences）仪器为例。仪器主要分为主机部分（包括激光激活源，射流，射线探测器）和计算机部分（CELLQuest softwere）。仪器的操作分为使用前的准备、使用中的操作和使用后的清洗。
1.使用前的准备
（1）打开电源：包括系统电源和主机部分电源。
（2）检查供液槽和废液槽：供液槽应含足够的仪器缓冲液，废液���应在上次使用后清洗干净。
（3）使机器处于负亚状态，才能使细胞悬液被吸入至机器的吸管口。
（4）机器处于可应用状态时，指示灯会变成绿色。
2.使用中的操作
（1） 计算机部分—使用CELLQuest程序系统软件：
①设定所要检测细胞的数量：一般设10 000~20 000个细胞。
②命名本次实验：一般含使用者的姓名和实验日期。
③打开记数部分：显示进入的细胞数以及检测一定量的细胞所需要的时间。
④将微机与主机连接：控制检测时的预检测和实际检测。
⑤主机设定：一般是已设定好的适合测定**细胞的条件，包括探测器的电压。探测器的电压是调空光电倍增管所能检测荧光密度的范围。
⑥选择检测的波长和表达方式（plot）：如果用一种荧光抗体，一般选直方图（histogram）；如果用两种荧光抗体，常选点状二维图（dot plot）或轮廓线图（contour plot）表
CD69分子表达检测直方图的数值说明
b.abti-CD3（2 ng/ml）检测结果
c.abti-CD3（10 ng/ml）检测结果
CD4及CD8细胞点状二维图结果
不同的荧光物要求选择不同的激发波长，参见下表
（2）细胞的吸入：将装有细胞的FACS测定管放置到机器吸管孔处。
先预检测样品，然后进行实际检测。可根据细胞的浓度选择测定的速度（低、中或高）。所有的数据将自动存入微机。
3.使用后的清洗 所有样品测定完后，要进行仪器的清洗。
（1）将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入1分钟。
（2）将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入 1分钟。
（3）再将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入5分钟。
（4）同样再将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入5分钟。
（5）*后将一装有双蒸水的FACS管放置机器吸管孔后，关闭机器。
（6）将废液槽中的废液倒掉，并清洗干净废液槽。
收起
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