甲基化特异性PCR
标签： 甲基化 特异性 PCR
DNA甲基化是一种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferase, Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是**存在的化学性修饰碱基。
|
实验方法原理
|
MSP是一种简便、特异的、敏感的检测单基因甲基化的方式。其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因 组DNA，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，然后用3对特异性的引物对所测基因的同一核苷酸序列进行扩增。扩增产物用DNA琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描观察分析结果。
|
|
实验材料
|
DNA
|
|
试剂、试剂盒
|
亚硫酸氢钠、氢醌、石蜡油、乙醇
|
|
仪器、耗材
|
水浴锅、PCR仪
|
|
实验步骤
|
1. 在50 μl 体系中，DNA（2~5 μg）经NaOH（终浓度值0.2 mol/L）在37℃变性10 Min。
2. 对于ng级别的人基因组DNA，在进行修饰前加入2μg蛙鱼精DNA为载体。
3. 加入30 μl 刚配制好的10 mmo/L 氢醌与520/1的40.5%亚硫酸氢钠混匀。
4. 然后用石蜡油隔绝空气的条件下，避光在50%温育16 h。
5. 修饰后的DNA过WizerdDNA纯化柱，用50/1 L 水洗脱。
6. 室温下用NaOH（终浓度为0.3 mol/L）修饰5 min，之后用乙醇沉淀。
7. DNA溶于20 μl 水中，立即使用或在-20℃保存。
|
