cDNA文库构建/EST测序分析|实验技术服务

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测序实验流程：
1、mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量蛋白质的能力。无细胞翻译系统(Cell-free translation system)，又叫体外转录-翻译的偶联系统,因为该系统需要制备无细胞提取物,还有人称之为"溶胞粗制品翻译系统"。
无细胞提取物的制备:
用机械的,超声波的,渗透压或用适当的去污剂等方法,将细胞溶破,再高速离心出去其质膜与细胞核等.该提取液中含有RNA聚合酶,核糖体,tRNA和能量发生系统.
常见的体外无细胞翻译系统:
兔网织红细胞系统。网织红细胞无细胞核,其合成的蛋白质90%以上为珠蛋白.
缺 点:已含有珠蛋白mRNA.可以在该体系中加入微球菌核酸酶和Ca2+,可很快分解,除去体系中的珠蛋白mRNA 。
麦胚系统用组织捣碎机将麦子捣碎,分离出麦胚.然后将粗制的麦胚加10倍体积的缓冲液与砂子共研磨.23000g离心所得的上清夜称为S23 ;将S23分装,保存于-20°C冰箱中.
利用麦胚系统进行蛋白质翻译合成研究时,需加的物质与网织红细胞系统相似.由于该体系无mRNA,所以必须加入mRNA。
优 点:适于研究mRNA,活力强,价格低廉等.
缺 点:不同制品的活性差别较大,且合成分子量较大(71X105 Dal)的蛋白质时往往提前终止.
哺乳动物mRNA在红细胞裂解液中翻译
2、mRNA在无细胞体系中指导合成目的多肽的能力
3、mRNA分子的大小
哺乳动物mRNA长度为500-8000bp,大部分mRNA位于1.5-2.0kb之间.
4、总mRNA指导合成cDNA**链长分子的能力
利用哺乳动物细胞提取的poly(A)+RNA合成cDNA
磁珠法分离mRN
1. 在RNase-free的Eppendorf 管中加入0.1~1.0mg的总RNA和RNase-free水至终体积为500ul.
2. 65ºC加热10分钟。
3. 加入3ul生物素标记的Oligo(dT)和13ul20×SSC于RNA中，轻轻混合，室温放置逐渐冷去至室温，一般需10 分钟左右。
4. 同时配0.5×SSC 1.2ml和0.1×SSC 1.4ml.
5. 将磁珠(SA-PMPs)轻晃散开，放入磁性分离架上，使SA-PMPs集中于管的一侧(约30sec)，小心去上清，切不可离心。用0.3ml 0.5×ssc漂洗SA-PMPs,用磁性分离架集中磁珠，去除上清，重复3次。
6. 将漂洗后的SA-PMPs重新悬浮于0.1ml 0.5Xssc,注意漂洗后的SA-PMPs应在30分钟内使用。
7. 将(3)中的oligo(dT)/mRNA退火反应物全部加入含漂洗好的SA-PMPs管中，轻轻摇匀，室温下放10 分钟。
8. 用磁性分离架捕获SA-PMPs,小心去上清，但不要弃去。
9. 用0.1×SSC,每次0.3ml洗3次，每次都晃至SA-PMPs悬浮，*后一次漂洗后尽可能多的吸取水相，而不损坏SA-PMPs.
10.将SA-PMPs重新悬浮在0.1ml RNase-free水中，反复颠倒，使SA-PMPs散开，洗脱mRNA。
11.用磁性分离架捕获SA-PMPs,将洗脱的mRNA吸入另一个新的Eppendorf管中。
12.将SA-PMPs再悬浮于0.15ml RNase-free的水中，洗脱，与(11)步洗脱液合并。
13.将得到的mRNA溶液取几微升跑电泳，若mRNA浓度不足以进行下一步的反转录，则需将得到的mRNA溶液浓缩(浓缩步骤见14-18)。
14.加0.1体积的3mol/l NaAc和1.0体积的异丙醇于洗脱液中，-20ºC沉淀。
15.4ºC，13000g离心60 分钟。去上清，加入500ul 70%乙醇混匀。
16.4ºC，7500g离心10 分钟。
17.去上清，真空或空气中自然风干，但不要太干，加适量RNase-free水溶解。
18.重复步骤5-12，将步骤8保留下的样品重新上柱
注意事项:
1.所有操作均需要严格戴手套，戴口罩进行
2.如果total RNA质量高，杂质少，就选择Oligotex的方法分离mRNA，相反则可以用磁珠法。
3.mRNA的电泳图是smear。