cDNA文库构建/EST测序分析服务|实验技术服务

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cDNA文库构建/EST测序分析服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
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测序实验流程：
1、mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量蛋白质的能力。无细胞翻译系统(Cell-free translation system)，又叫体外转录-翻译的偶联系统,因为该系统需要制备无细胞提取物,还有人称之为"溶胞粗制品翻译系统"。
无细胞提取物的制备:
用机械的,超声波的,渗透压或用适当的去污剂等方法,将细胞溶破,再高速离心出去其质膜与细胞核等.该提取液中含有RNA聚合酶,核糖体,tRNA和能量发生系统.
常见的体外无细胞翻译系统:
兔网织红细胞系统。网织红细胞无细胞核,其合成的蛋白质90%以上为珠蛋白.
缺 点:已含有珠蛋白mRNA.可以在该体系中加入微球菌核酸酶和Ca2+,可很快分解,除去体系中的珠蛋白mRNA 。
麦胚系统用组织捣碎机将麦子捣碎,分离出麦胚.然后将粗制的麦胚加10倍体积的缓冲液与砂子共研磨.23000g离心所得的上清夜称为S23 ;将S23分装,保存于-20°C冰箱中.
利用麦胚系统进行蛋白质翻译合成研究时,需加的物质与网织红细胞系统相似.由于该体系无mRNA,所以必须加入mRNA。
优 点:适于研究mRNA,活力强,价格低廉等.
缺 点:不同制品的活性差别较大,且合成分子量较大(71X105 Dal)的蛋白质时往往提前终止.
TRIzol Reagent 提取total RNA(GIBCO)
1. 查表2根据样品量选择适当的 TRIzol Reagent体积装入50ml RNase-free离心管中，注意样品体积不能超过TRIzol Reagent体积的10%。
2. 将组织样品放入TRIzol Reagent中，高速下匀浆15-30秒/次，直至看不见组织和细胞碎片。
3.室温温育10分钟 。
4. 据表2加入适量体积的氯仿，剧烈震荡15秒钟，然后室温下温育3分钟。
5. 4ºC，12000g离心15分钟，形成淡红色的苯酚/氯仿有机相，中间相和上层水相，水相约占TRIzol体积的60%。
6. 转移上清于另一个Rnase-free的 50ml离心管中。根据表2加入适量异丙醇，-20ºC沉淀1小时以上。
7. 4ºC,12000g离心10分钟。
8. 去上清，据表2加入适量体积的75%的乙醇混匀。
9. 4ºC，7500g离心5分钟。
10. 去上清，空气中干燥或真空抽干RNA沉淀，但不要太干。加入适量体积的DEPC-WATER,溶解沉淀。
11. 取少量RNA用于测定其OD值和电泳，其余置-80ºC冰箱中保存。
1 核酸杂交
是*常用,*可靠的方法之一.可大规模地分析文库的克隆子.
1)同源探针:至少含有所需cDNA克隆的一部分确切序列.常用于以一个部分克隆分离cDNA文库中的全长克隆.
2)部分同源探针:探针的序列与所要筛选的cDNA克隆的序列相关但不相同.常用于克隆家族基因.
3)总cDNA探针:
通过反转录酶均匀掺入放射性核苷酸或通过总的或分级分离得到的poly(A)+mRNA进行末端标记而获得cDNA探针.
cDNA扣除探针:
从**种mRNA制备cDNA探针, 连续多次与20倍过量的**种mRNA杂交;
回收未杂交的cDNA探针, 再与100倍过量的**种mRNA杂交, 使得原mRNA中的一些特异序列得到高度富集.
* 主要用于探测cDNA文库中与调节水平有所差别的mRNA克隆.
5)合成寡核苷酸探针
2 特异性免疫学检测
在cDNA表达文库中,目的基因的表达产物能与特异性抗体发生免疫学反应,通过酶学的方法加以检测
3 cDNA克隆的同胞检测
将cDNA文库分成若干组含有10-100个克隆子的易于处理的亚cDNA文库,对每组亚cDNA文库进行检测,当鉴定出阳性库后再不断将其分成更细的库进行检测,直到获得阳性单克隆.
4 cDNA克隆的确证
cDNA克隆含有编码某一特定蛋白质的完整氨基酸序列的开放读框.
第四节 目的基因的分离
外源基因:
插入到载体内的那个特定的片段基因.
目的基因:
那些已被或者准备要分离,改造,扩增或表达的特定基因或DNA段.