RNAi质粒载体构建技术服务|实验技术服务

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测序实验流程：
近年来的研究表明,一些短片断的双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型, 称为RNA干扰（RNA interference,RNAi）.siRNA（small interfering RNAs）就是这种短片断双链RNA分子,能够以序列同源互补的mRNA为靶目标,降解特定的mRNA.RNAi的发现具有划时代的意义,它不仅深入揭示 了细胞内基因沉默的机制,而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具,极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程.现在越来越多的研究人员开始采用RNAi 来研究生物体的基因表达.RNAi技术可广泛应用到包括功能基因组学,药物靶点筛选,细胞信号传导通路分析,疾病治疗等等.
目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括：
·化学合成
·体外转录
·长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)
·siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs
·PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达
获得高纯度的siRNA产物是进行实验的**步,而转染的效率则是非常关键的因素.
RNAi表达载体的构建
1. 目的基因的确定
2、设计siRNA靶序列
基本步骤：
（1）将100μl感受态细胞于冰上解冻.
（2）取5μl连接产物加入到感受态细胞中,轻轻旋转几次以 混匀内容物. 在冰上放置30分钟.
（3）将管放入预加温到42℃的水浴中,热激90秒.快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却1~2分钟.
（4）每管中加700μl LB培养基,37℃振荡培养1小时,进行复苏.
（5）室温4,000rpm离心5分钟,弃去上清后,用剩余100μl培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面.注意：细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整.
（6）将平板置于室温直至液体被吸收.
（7）倒置平皿,于37℃培养,12~16小时后可出现菌落.
RNAi：（RNA interference）RNA干扰
内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的能诱导细胞内与其序列同源的特异基因表达沉默或抑制的效应,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,称为RNA干扰,它也是体内抵御外在感染的一种重要保护机制.
siRNA ：(small interfering RNAs)小干扰RNA
由长dsRNA裂解而成的一种19-25nt的短片断双链RNA分子,能够以同源互补序列的RNA为靶目标降解特定的mRNA, RNAi的关键效应分子.
shRNAs:(small hairpin RNA )小发夹RNA
是设计为能够形成发夹结构的非编码小RNA分子,shRNA需通过载体导入细胞后,然后利用细胞内的酶切机制得到siRNA而*终发挥RNA干扰作用.
Dicer：属于RNaseⅢ 家族,是dsRNA的特异性核酸内切酶
RISC：(RNA-inducing silencing complex) RNA诱导的沉默复合体,具有核酸内切、外切以及解旋酶活性.