Southern Blot技术服务|实验技术服务

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测序实验流程：
一、 待测核酸样品的制备
(一)制备待测DNA
基因组DNA是从动物组织(或)细胞制备。1.采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞;2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA;3.用有机试剂(酚/氯仿)抽提方法去除蛋白质。
(二) DNA限制酶消化
基因组DNA很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化DNA。一般选择一种限制酶来切割DNA分子，但有时为了某些特殊的目的，分别用不同的限制酶消化基因组DNA。切割DNA的条件可根据不同目的设定，有时可采用部分和充分消化相结合的方法获得一些具有交叉顺序的DNA片段。消化DNA后，加入EDTA，65℃加热灭活限制酶,样品即可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩DNA样品后再进行电泳分离。
预杂交(prehybridizafion)
(一) 配制预杂交液:6XSSC，5XDenhardt's试剂，0.5%SDS，50%(v/v)甲酰胺，ddH2O，100ug/ml鲑鱼精DNA变性后加入。注:1.每平方硝酸纤维素膜需预杂交液0.2ml。2.预杂交液制备时可用或不用poly(A)RNA。3.当使用32P标记的cDNA作探针时，可以在预杂交液或杂交液中加入poly(A)RNA以避免探针同真核生物DNA中普遍存在的富含胸腺嘧啶的序列结合。4.按照探针、靶基因和杂交液的特性确定合适的杂交温度(Thyb)。(如果使用标准杂交液，靶序列DNA GC含量为40%，则Thyb为42℃。)
(二)把预杂交液放在灭菌的塑料瓶中，在水浴中预热至杂交温度。
(三)将表面带有目的DNA的硝酸纤维素滤膜放入一个稍宽于滤膜的塑料袋，用5-10ml2×SSC浸湿滤膜。
(四)将鲑鱼精DNA置沸水浴中10min，迅速置冰上冷却1-2min，使DNA变性。
(五)从塑料袋中除净2×SSC，加入预杂交液，按每平方滤膜加0.2ml。
(六)加入变性的鲑鱼精DNA置终浓度200μg/ml。
(七)尽可能除净袋中的空气，用热封口器封住袋口，上下颠倒数次以使其混匀，置于42℃水浴中温育4h.
Southern杂交
(一)原理
转印后的滤膜在预杂交液中温育4-6h，即可加入标记的探针DNA(探针DNA预先经加热变性成为单链DNA分子)，即可进行杂交反应。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行。杂交然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度越低，温度越高，杂交的严格程度越高，也就是说，只有探针和待测顺序之间有非常高的同源性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。
(二) 步骤
1.将标记的DNA探针置沸水浴10min，迅速置冰上冷却1-2min，使DNA变性。
2.从水浴中取出含有滤膜和预杂交液的塑料袋，剪开一角，将变性的DNA探针加到预杂交液中。
3.尽可能除取袋中的空气，封住袋口，滞留在袋中的气泡要尽可能地少，为避免同位素污染水浴，将封好的杂交袋再封入另一个未污染的塑料袋内。
4.置42℃水浴温育(至少18h)。
结果注意:
在膜上阳性反应呈带状。实验中应注意以下问题:转膜必需充分，要保证DNA已转到膜上。杂交条件及漂洗是保证阳性结果和背景反差对比好的关键。洗膜不充分会导致背景太深，洗膜过度又可能导致假阴性。若用到有毒物质，必需注意**及**。
主要应用:
1.遗传病诊断
2.DNA图谱分析
3.检测样品中的DNA及其含量
4.PCR产物分析