Transwell实验技术服务|实验技术服务

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测序实验流程：
检测穿过的细胞数有两种方法：
1 ) 直接计数法
“贴壁”细胞计数:
 “贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。 通过给细胞染色，可在镜下计数细胞
A. 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞
B. 染色：常用的0.1%结晶紫染色。
优点：(1) 不需固定细胞，直接染色即可。
(2) 配制简单方便。
(3) 可以用33%醋酸脱色，测量洗脱液OD570值，间接反映细胞数
注意，染色前要将膜风干，否则可能会染不上。
C. 细胞计数：
(1) 显微镜进行观察和拍照
(2) 取3-5个视野计数细胞个数
2) 间接计数法
用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确的细胞数。
MTT法
A. 棉签擦去基质胶和上室内的细胞
B. 24孔板中加入500µl含0.5mg/ml MTT的完全培养基，将小室浸没于其中，置于37℃2-4h后取出。
C. 24孔板中加入500µl DMSO，将小室浸没于其中，振荡结晶充分溶解。
D. 取出小室，测所得DMSO的OD值。
结晶紫检测
A. 棉签擦去基质胶和上室内的细胞
B. （可选）甲醛固定30分钟，室温
B. 24孔板中加入500µl  0.1%结晶紫溶液，将小室浸没于其中，室温放置20分钟
C. 24孔板中加入500µl 33%醋酸，将小室浸没于其中，脱色。
D. 取出小室，测量洗脱液OD570值。
优点：染色和脱色的过程并不影响膜上细胞，在脱色后还可重新染色。
一、肿瘤细胞侵袭实验（transwell）
原理：
模仿体内细胞外基质，细胞只有分泌基质金属蛋白酶（MMPs），降解基质胶才可进入下室。
步骤
1.  Transwell小室准备
1）无基质胶Transwell小室制备
A. 包被基底膜：
A. Matrigel (50mg/L)按1:8稀释，无血清培养基作为稀释液
B. 取适量加入Transwell小室中(24孔板transwell小室加100 ul)，4℃操作。
C. 37℃培养箱中，孵育4-5h（>5h）；出现“白色层”时，说明已经变为固态。
2）有基质胶Transwell小室制备
A. 小室放入培养板中，上室加入300µl预温的无血清培养基
B. 室温下静置15－30min，使基质胶再水化
C. 再吸去剩余培养液。
2．细胞悬液准备
1）消化、收集细胞；
2）PBS洗1－2次
3）用含BSA的无血清培养基重悬（细胞密度约在1－10×105/ml）。
3. 细胞接种
1）取适量细胞悬液加入Transwell小室（按transwell说明）。24孔板小室一般200µl。
2）24孔板下室一般加入500µl含FBS或趋化因子的培养基。注意避免气泡产生（下层培养液和小室间）
3） 培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。
4. 结果统计