基于慢病毒载体的miRNA载体构建技术服务|实验技术服务

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基于慢病毒载体的miRNA载体构建技术服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
我们具备丰富的蛋白表达设计经验及实验操作技巧，承诺客户不成功不收费。我们所有的实验数据真实可信，我们提供原始的表达菌株和克隆质粒，客户可以依据我们的实验报告重复我们的实验结果。
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测序实验流程：
慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
miRNA是一种21－25nt长的单链小分子RNA, 是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，miRNA具有高度的保守性、时序性和组织特异性.而且这种特异性和时序性，决定了组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用，因此miRNA的研究受到了生物学家的广泛关注。 
本中心可以将客户研究的miRNA构建到慢病毒载体，生产的病毒颗粒可以直接用于感染细胞或者动物实验。可以选择将Pri-miRNA或者PremiRNA构建到载体，构建中也可以根据实验需要选用不同的Flank.
特点：
1．可以稳定长期的表达miRNA，可以用于筛选稳定细胞模型用于长期的研究和观察。 
2．感染效率高而且可以感染绝大部分细胞种类。 
3．可以直接用于动物实验或者感染细胞后回输到动物体内。
1.将actin基因，放入慢病毒融合表达载体，与荧光蛋白（GFP）融合表达，注意避免移码突变。
2.然后将重组质粒以及辅助质粒共转染细胞，可以用脂质体法，慢病毒配套细胞一般为293。
3.收集慢病毒，浓缩。
4.用慢病毒转染原代细胞。做好先做预实验。
5.重组蛋白（例如，GFP-actin）在细胞内表达后，自然的混入细胞骨架中，将之标记绿色荧光。
（一） 实验流程（1和2为并列步骤）
1.慢病毒过表达质粒载体的构建
设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。
2.慢病毒干扰质粒载体的构建
合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体
3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化
制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
(二) 实验材料
2.1慢病毒载体、包装细胞和菌株
该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中质粒上的ZsGreen1表达框能表达绿色荧光蛋白（GFP）。
存在问题
首先，重组病毒的滴度还不够高，除Naldini等报道的结果外，其余均在101TU/ml~103TU/ml之间，难以达到体内应用的需要;
其次，由于HIV复杂的生物学性质，要像常用的小鼠逆转录病毒载体那样建立稳定的HIV载体包装细胞十分困难，已建立的包装细胞均不理想。
更为谨慎的做法是，以非人类的慢病毒为基础构建载体，如猴免疫缺损病毒(SIV)、猫和牛免疫缺损病毒(FIV和BIV)、马传染性贫血病病毒等，而这些工作尚属空白。