流式细胞术检测技术服务|实验技术服务

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流式细胞术检测技术服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
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测序实验流程：
PI 染色操作步骤
1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定。
4、离心，弃上清液。
5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。
7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。
9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。
细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤
1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm，5min，弃上清液。
2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。
3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。
4、离心弃上清液。
5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。
6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。
胞内直接免疫荧光染色操作步骤
1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、用1×PBS1ml洗涤1次，离心。
3、4%PFA 1ml，4℃固定30min。
4、用1×PBS1ml洗涤1次，离心。
5、0、1% Triton-100 1ml, 室温10min。
6、用1×PBS1ml洗涤1次，离心。
7、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul，用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。
8、离心弃上清液。
9、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。
10、向细胞中加入冷PBS500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。
备注：                                                
1、RNase A：贮液浓度：1mg/ml；
工作液配制：加1 mg/ml贮液 10ul于500ul 1×PBS中，使终浓度为 20ug/ml。
2、PI：贮液浓度：2、5mg/ml；       
工作液配制：加2、5 mg/ml贮液 10ul于500ul 1×PBS中，使终浓度为 50ug/ml。
3、PBA：即PBS加1-2% 牛血清白蛋白，加0、1%叠氮钠。
4、检测样品细胞浓度1x106 /ml。
流式细胞术测细胞表面抗原步骤
1. 定量细胞浓度
2. 分为2组，一组为实验组，另一组为抗体对照组
3. 两组都先加入非特异性的IgG，封闭可能的Fc受体
4. 按照抗体生产厂家的推荐浓度加入抗体，对照组加入同样荧光标记的非特异性同型抗体。
5. 4°孵育半小时
6. 用含0.5% BSA的PBS洗2遍
7. 上机后先用抗体对照组设置阴性Gate。
8. 检测样本。
方法学程序
（1） 将适合于酶消化的组织置于离心管中；
（2） 将选好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化组织的试管中；
（3） 一般消化20-30分钟（恒温37℃或室温），消化期间要间断振荡或吹打；
（4） 终止消化，收集细胞悬液，以300目尼龙网过滤，除去细胞团块，以低速成离心除去细胞碎片；
（5） 将制备好的单细胞悬液进行进一步荧光染色后上机检测，或保存备用。