侵袭小室实验|实验技术服务

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测序实验流程：
侵袭小室小室制备
① 包被基底膜：
用50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200ul枪头的**剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。
② 水化基底膜：
吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37℃，30min。
另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80µl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为*好)，置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝胶。
有基质胶的Transwell小室制备
Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300µl预温的无血清培养基，室温下静置15－30min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。
制备细胞悬液
① 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。
② 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1－10×105。
具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果*后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此*少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。
个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。
接种细胞
① 取细胞悬液100－200µl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200µl。
② 24孔板下室一般加入500µl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
③ 培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。
通过给细胞染色，可在镜下计数细胞
① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞
② 染色：常用的染色方法有结晶紫染色、台肦蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等。
优势：
(1). 不需要固定细胞，直接染色即可。
(2). 配制简单方便。
(3). 染色后可以用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm 测其OD值，间接反映细胞数。