实时荧光定量PCR技术服务|实验技术服务

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实时荧光定量PCR技术服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
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测序实验流程：
1 收集样品
2 相关试剂 总RNA提取试剂TREzol Reagent (RNA提取试剂), M-MLV(cDNA逆转录酶), RNA 纯化试剂, RealqPCR MasterMix (荧光定量PCR预混试剂)。
3 实验仪器 荧光定量PCR仪; PCR仪;低温离心机。
4 总RNA提取
5 cDNA合成 在0.5ml的离心管中加入1µl模板总RNA(1µg/µl); 2µl随机引物(T18, 10pmol/ul);2µl 10mM dNTP mix;加水至15µl体系。混匀后70℃变性RNA 5分钟，冰上速冷1分钟，离心将溶液收集至管底加入6µl 5×PCR buffer;1µl RNaseout;1µl M-MLV RT;加水至30µl体系。PCR仪中反应条件设置 37℃延伸60min，70℃保温15min终止反应。合成好的cDNA置于 -20 ℃保存备用。
6 引物设计与thermal cycler protocol thermal cycler protocol合成
7 实时定量PCR 按以下反应体系进行: 2x RealqPCR MasterMix(Modified DNA polymerase、SYBR Green I、Optimized PCR buffer、5mM MgCI2、dNTP mix including dUTP)25ul;上游引物F 1 ul，下游引物R 1 ul;cDNA template 2ul。定量PCR仪扩增反应条件设置:50 ℃ 2min ;95 ℃ 10min ;95℃ 15s --60 ℃ 60 s (40个循环)。
8 PCR产物溶解曲线分析 将所扩增的PCR 产物进行溶解曲线分析，单峰溶解曲线表示扩增产物单一，无非特异性扩增产物。溶解曲线生成的反应程序为: 95 ℃ 15s , 60 ℃ 15 s , 95 ℃ 15s。
9 数据分析软件对数据进行处理分析。
实时荧光定量PCR技术的主要应用
1. DNA 或RNA 的**定量分析:包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等;
2. 基因表达差异分析:例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等 )，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证;
3. 基因分型:例如SNP 检测，甲基化检测等。
样品cDNA合成 
1.  反应体系
序号          反应物           剂量
1          逆转录buffer       2 μl
2         上游引物              0.2 μl
3         下游引物              0.2 μl
4          dNTP                   0.1 μl
5       逆转录酶MMLV     0.5 μl
6         DEPC水              5 μl
7          RNA模版            2 μl
8           总体积               10 μl
轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。
2.  混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5 μl，37℃水浴60分钟。
3.  取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。