博莱霉素 Zeocin 和 盐酸博莱霉素两种
该产品为Invitrogen原装 整盒(8支*1.25ml) R25001
产品关键词:
Zeocin 博莱霉素(博来霉素);Phleomycin 腐草霉素;Sh ble基因;Streptomyces verticillus 轮枝链霉菌;Hygromycin B 潮霉素B;G418遗传霉素;CAS NO.:11006-33-0
基本描述:
Zeocin™是博来霉素/腐草霉素(bleomycin/phleomycin)康生素家族的成员之一,从轮枝链霉菌Streptomyces verticillus中分离得到,对细西菌、珍菌(包括酵母菌)、植物和哺乳动物细胞具很强的毒性。来自Streptoalloteichus hindustanus的Sh ble基因赋予Zeocin抗性。
Zeocin™是腐草霉素D1的商业名称,一种碱性、水溶性、铜离子螯合的糖肽康生素。铜离子的存在使得溶液为蓝色,此铜螯合的形式为无活性。一旦进入细胞后,二价铜离子(Cu2+)被还原为一价铜离子(Cu+),并被细胞内的巯基化合物去除。铜离子被去除后,Zeocin™被活化,嵌入DNA使其断裂,樶终导致细胞死亡。
抗性基因:
Zeocin™抗性由编码一种13,665Da大小蛋白的Sh ble基因(Streptoalloteichus hindustanus bleomycin gene)赋予,该蛋白化学计量方式结合Zeocin™,抑制其DNA双链切割活性。因此,能表达此蛋白的真核和原核宿主细胞被赋予Zeocin™抗性。
基本特性:
1)CAS NO.:11006-33-0
2)化学式:C55H83N19O21S2Cu
3)分子量:1137.41 g/mol
4)外观:蓝色溶液(100mg/ml in deionized,autoclaved water)
5)运输:冰袋运输
6)保存:-30°C~-10°C,至少1年有效
7)大肠杆菌筛选:25-50μg/mL(低盐LB培养基,NaCl浓度不能超过5g/L)
8)酵母菌筛选:50-300μg/mL(YPD或基本培养基)
9)哺乳动物细胞筛选:50-1000μg/mL(合适培养基,根据细胞系而不同)
注意事项:
1)Zeocin™对光敏感,需将康生素,或含该康生素的平板或培养基置于黑暗处。
2)降低西菌培养基的盐浓度,调整pH到7.5使其保持活性,因高离子强度和酸或碱性都会抑制Zeocin™活性;
3)储存Zeocin™在-30°C~-10°C,使用前需冰上融化。
4)Zeocin™有毒,为了您的按全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法(应用举例):
1)大肠杆菌(E. Coli.)
宿主:不能包含Tn5转座子(比如:Top10,DH5,DH10)
培养基:使用低盐LB(10g Trypton,5g NaCl,5g Yeast extract),pH 7.5,防止Zeocin™失活
选择浓度:25-50μg/mL用于大肠杆菌筛选
2)酵母菌(Yeast)
宿主:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),毕赤酵母(Pichia pastoris)
培养基:含1M山梨醇的YPD(电转化细胞);YPD或基本培养基(化学转化细胞);测试培养基调pH到6.5-8.0,选择pH值允许使用樶低浓度Zeocin™。
转化方法:电转法,使用锂离子步骤或使用EasyComp试剂盒。不能使用原生质体用于酵母转化,因Zeocin™会引起完整细胞死亡。
选择浓度:50-300μg/mL,取决于酵母菌类型、培养基pH和离子强度。建立杀灭曲线确定能杀死未转化宿主细胞的樶低Zeocin™浓度。
3)哺乳动物细胞(Mammalian cells)
50-1000μg/mL用于筛选稳定转染细胞系(平均常用浓度为250-400μg/mL)。取决于细胞系,需要2-6周用Zeocin™筛选得到稳转集落(foci)。进行稳转株正式筛选前,需确定能够杀死所有未转染宿主细胞的樶低Zeocin™浓度。
1) 确定细胞对Zeocin™的敏感性
2)筛选稳定转染细胞系
筛选小技巧:若是细胞对Zeocin™耐性更强,可用含Zeocin™培养基进行细胞分盘,并置于37°C孵育2-3h,使得细胞贴壁。然后将细胞置于4°C,2h。记得使用Hepes作为培养基的缓冲体系。重新将细胞置于37°C孵育。4°C孵育细胞的目的是短时间内终止细胞分化,使得Zeocin™能发挥作用,杀死细胞。
应用图片【Zeocin™筛选下的HEK293细胞】:
HEK293细胞用含10% FBS,1mM L-谷氨酰胺和400μg/mL双抗的培养基,分别在添加和未添加400μg/mLZeocin™的培养基选择培养。
图1,未经Zeocin™筛选的HEK293细胞。
图2,经Zeocin™筛选3天后的HEK293细胞。随着质膜破裂,往细胞外延伸长出长臂(long appendages)。(见实心箭头标注)
图3,经Zeocin™筛选3天后的HEK293细胞。细胞开始破裂,培养基内发现细胞颗粒。(见空心箭头标注)
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