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高效液相色谱法检测饲料中孔雀石绿的方法

高效液相色谱法检测饲料中孔雀石绿的方法

孔雀石绿（malachitegreen）又称为苯胺绿、维多利亚绿或中国(China)绿，是一种具有金属光泽的绿色晶体。孔雀石绿的化学官能团三苯沼气(CH4)是一种致癌物资，且其易在鱼体内和情况中残留，存在致突变、致畸和致癌的危险，故我国、美国(United States)、加拿大(Canada)以及欧盟等很多国度均制止其在经济鱼类（观赏鱼除外）和人类食用鱼中应用。鱼粉是饲猜中动物卵白的重要起源，含有孔雀石绿及其代谢物的鱼粉添加到饲猜中可经由进程食品链要挟到人类健康。

    我所现采用NY/T 1756-2009标准，应用深圳普分科技有限公司高效液相色谱法（HPLC）对饲料中孔雀石绿进行测定，本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料、鱼粉中孔雀石绿和无色孔雀石绿含量的测定。液相色谱法孔雀石绿和无色孔雀石绿的定量限均为 10μg/kg；液相色谱-串联质谱法的定量限均为 1.0 μg/kg。现将该方法简要介绍如下：
    1.原理以乙腈-乙酸钠缓冲溶液提取样品中的孔雀石绿和无色孔雀石绿，提取液经过二氯甲烷液液萃取，再经固相萃取柱净化，用接有二氧化铅柱的氰基柱进行高效液相色谱分离，紫外可见光检测器检测，外标法定量。
    2. 分析步骤
    2.1 提取称取饲料样品约 5g (**到 0.001g) ，置于100ml离心管中，依次加入1.5ml盐酸羟胺溶液、2ml对甲苯磺酸溶液、5ml乙酸钠缓冲溶液和 20 ml乙腈，加入约2g 酸性氧化铝，振荡2min，超声30 min，4 000 r/min 离心5 min。将上清液转移至250 ml分液漏斗中，向离心管中再次加入20 ml乙腈，振摇2 min，4000 r/min 离心5 min，合并上清液至分液漏斗中。
    2.2 液液萃取加入50ml氯化钠溶液、50ml二氯甲烷，旋摇，静置分层。用蒸发瓶收集下层液体后，在分液漏斗再次加入 20ml二氯甲烷，旋摇，静置分层，收集下层液体于同一蒸发瓶。将收集液35℃下减压旋转蒸发(注意：开始时温度不要直接升35℃，以免爆沸)至近干，加入5 ml，乙腈溶解残渣，备用。
    2.3 净化
    2.3.1 固相萃取柱的活化按中性氧化铝柱在上、PRS 柱在下的顺序将两柱串联，使用前用 5ml乙腈预洗两柱。
    2.3.2上样将2.3.1的样液缓慢转移到中性氧化铝柱内,在抽真空情况下过柱(保持流速 1 ml／min) 。再用5ml乙腈洗涤蒸发瓶2次，洗涤液均转移至柱内，*后用 5 ml乙腈洗涤小柱。
    2.3.3洗脱收集弃去中性氧化铝柱，用乙腈-乙酸钠缓冲溶液2ml、盐酸羟胺甲醇溶液lml洗脱，收集洗脱液，过膜(孔径0.45μm)，上机测定。
    2.4样品测定
    2.4.1色谱条件
    色谱柱：氰基柱，250 mm ×4.6 mm，柱后氧化铅柱：35 mm×4.6 mm。流动相：乙腈＋乙酸钠缓冲溶液＝60＋40 (v＋v) ；
    流速：1.0 ml/min 。
    柱温：室温。
    进样量：50 μl。
    检测波长：600 nm。
    2.4.2定量测定按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数。向液相色谱仪中注入孔雀石绿和无色孔雀石绿标准工作液及试样溶液，得到色谱峰面积响应值，用外标法定量。

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