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载体质粒简介和原理
载体质粒是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的质粒。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如***抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。
简介
载体质粒是小型环状DNA分子,在基因工程中作为*常用,*简单的载体,必须包括三部分:遗传标记基因,复制区,目的基因。 质粒在所有的**类群中都可发现,它们是独立于**染色体外自我复制的DNA分子。自然界中,质粒是在营养充足时出现的,它在结构、大小、复制方式,每个**的拷贝数,在不同的**体内的繁殖力不同,在菌种之间的转移力等方面都会变化,可能*重要的是质粒所携带的特征的改变。大多数原核生物的质粒是双链环状的DNA分子;但是无论是在革兰氏阳性还是阴性菌体内都可以发现线状质粒。质粒大小变化很大,可从几个到数百个kb。质粒依靠宿主细胞提供的蛋白质进行复制,但也可以使宿主细胞获得质粒编码的功能。质粒复制可以与**的细胞周期同步,导致菌体内质粒的拷贝数较低,质粒复制也可独立于细胞周期,使每个菌体内扩增了成百上千个质粒拷贝。一些质粒在菌种间可自由地转移它们的DNA分子,另一些只转移质粒给同种**,而有些却根本不转移它们的DNA。质粒带有具有许多功能的基因,这些功能包括对***和重金属的抗性、对诱变原的敏感性、对噬菌体的易感或抗性、产生限制酶、产生稀有的氨基酸和**、决定毒力、降解复杂有机分子,以及形成共生关系的能力和在生物界内转移DNA的能力。
基本特征
质粒(plasmid)是**或细胞染色质以外的,能自主复制的,与**或细胞共生的遗传成分。其特点如下:
是染色质外的双链共价闭合环形DNA
(covalently closed circular DNA,cccDNA),可自然形成超螺旋结构,不同质粒大小在2-300kb之间,<15kb的小质粒比较容易分离纯化,>15kb的大质粒则不易提取。
能自主复制,是能独立复制的复制子
其拷贝数可分两类:严紧控制(stringent control)型质粒的复制常与宿主的繁殖偶联,拷贝数较少,每个细胞中只有1个到十几个拷贝;另一类是松弛控制(relaxed control)型质粒,其复制宿主不偶联,每个细胞中有几十到几百个拷贝。每个质粒DNA上都有复制的起点,只有ori能被宿主细胞复制蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制,不同质粒复制控制状况主要与复制起点的序列结构相关。有的质粒的可以整合到宿主细胞染色质DNA中,随宿主DNA复制,称为附加体,例如**的性质粒就是一种附加体,它可以质粒形式存在,也能整合入**的DNA,又能从**染色质DNA上切下来。F因子携带基因编码的蛋白质能使两个**间形成纤毛状细管连接的接合(conjugation),通过这细管遗传物质可在两个**间传递。
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