**组化IHC/病理切片/HE染色/原位杂交技术服务

**组化；H.E染色；病理切片
 
上海拜沃生物为您提供 **组织化学IHC ，**细胞化学ICC ，原位分子杂交ISH 等组织形态学方面的一站式技术服务，包括实验设计、实验操作、图片采集，实验结果分析等方面，也可以承接阶段性的技术服务。检测指标：肿瘤标志物、癌基因及抑癌基因蛋白、细胞周期蛋白、凋亡基因蛋白、细胞表面抗原等。 样本及来源：石蜡切片、冰冻切片、细胞涂片或培养细胞；来源于人、小鼠、大鼠或其它。
 

1、组织的石蜡包埋与石蜡切片：
(1) 客户提供人或动物的新鲜或福尔马林固定的组织，我公司负责进行石蜡包埋与组织切片
(2) 客户提供人或动物的石蜡包埋组织及处理好的玻片，我公司制备石蜡切片，收费标准为

2、细胞片：
客户提供生长良好的一瓶细胞，本公司提供传代培养的所有器材和处理好的玻片，制备细胞爬片，每批可提供10 张左右细胞片。

3、常规HE 染色：
客户提供石蜡或冰冻切片。


4、**组织化学实验服务：
方法：使用HRP 标记系统进行检测

项目	单位	价格(元/ 人民币)	备注
病理片**组化	张
病理片**组化	张

 

 
7、其他实验：
1、石蜡包埋
2、HE染色，其他染色
3、脱钙：50元/标本(脱钙标本免除包埋费)
4、特殊染色：60元/片子
 
 
 
●说明：
1、  用户委托我公司进行**组织化学检测实验时须预付实验费50%。
2、  用户应说明检测目的、所选检测系统等，一次送检样本数不应少于10张切片。我公司在正式接受实验委托三周左右交付实验结果。所提供实验结果忠实于样本的实际情况。
3、  进行**组化检测实验所需的检测系统（不含一抗）由我公司免费提供，一抗须用户自行购买或委托我公司代购；用户所提供抗体应可与样本发生特异性识别反应。**组化检测显色系统分为辣根过氧化物酶-DAB体系及碱性磷酸酶-BCIP/NBT体系。
 
     由于用户提供的样品或试剂所致的实验问题由用户负责。我们的委托人可保留对于选择的服务的所有知识产权,每个项目都是在**保密的情况下进行的。
 
 
**组化实验技术对外服务步骤
简介：             
**组化是应用**学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为**组织化学技术(immunohistochemistry)或** 细胞化学技术(immunocytochemistry)。
**组化的分类：
**组织化学技术按照标记物的种类可分为**荧光法、**酶法、**铁蛋白法、**金法及放射**自影法等。
**组化主要步骤
1.   洗载玻片:   将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中,目的是为了是载玻片上的硅胶等除去,同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整,便于组织吸附,然后置于 清水中清洗,除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4(大约冲一个小时左右),再将载玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys带正电，而大多数的组织带负电荷，从而产生吸附作用。
2.  包埋组织:   先在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，*后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。
3.   切片：    将包埋好的组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致，然后调节切片的厚度，一般为5µm,如果比较难切，则可以适当调整厚度，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40°C温水中。
4.  捞组织：   当组织载玻片置于40°C温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，*好是组织不起皱纹，用载玻片捞组织时，一 般取载玻片的下1/3或者下1/2一般每种组织捞5-6张，其中2-3张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差就比较小了， 而且捞载玻片的时候*好方向一致，以便观察，再将捞出来的载玻片置于架子上，放入37°C温箱中烘干。
5.   脱蜡：   依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯,依据的是相似相溶的原理.一般在每个试剂中放10min,天气热可以少放几分钟,相反,天气较冷的话,就要适当延长脱蜡时间,一般为12-15min.
6.  抗原修复：  脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2浸泡10min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放 入微波炉中蒸煮3min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。
7. 血清封闭：   冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封 闭起来，然后放入37°C温箱中半小时。血清稀释10倍（900µlPBS：100µl血清封闭液）。
8.  加一抗：   将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存过夜。
9.  加二抗：   将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上二抗,然后置于37°C温箱中半小时。
10. 加SABC:    将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上SABC, 然后置于37°C温箱中半小时。SABC稀释100倍（990µlPBS：10µlSABC）。
11. 加显色剂：  将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上显色剂。（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀， 再加1滴显色剂C，摇匀）   A：DAB        B：H2O2        C：磷酸缓冲液
12.  复染：   将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一般动物组织为半分钟，植物组织3-5min。
13.  脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min，*后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。
14.  封片：  用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。
**组化的相关试剂：
*重要的是选择好一抗、二抗或者还有三抗，注意抗体的特异性、效价和交叉反应，*好用单抗。
其他常用试剂有：
1、0.01M(pH7.4)的磷酸盐缓冲生理盐水（PBS），稀释抗体和洗片子用；
2、清洁液、纯水，洗玻片用
3、多聚赖氨酸处理载玻片，防**片
4、固定液：4%多聚甲醛或冷丙酮等；
5、15%~30%蔗糖，组织脱水用；
6、梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，或者OCT包埋做冰冻切片；
7、抗原修复液：枸橼酸缓冲液（pH6.0）；
8、活化剂：EDTA或者Triton X-100；
9、1%~10%牛血清清蛋白（BSA）封闭液；
10、H₂O₂，灭活内源性过氧化物酶；
11、显色液：根据你做的酶来选择，如果是HRP就用DAB，如果是AKP，就用NBT/BCIP，**荧光则不需要；
12、50%缓冲甘油封片液。
**组化IHC/病理切片/HE染色/原位杂交技术服务