细胞爬片**组化（IHC）

1. 原理

    抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，**组织细胞化学技术正是利用了这一原理。先将细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过**动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。

    **细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把**反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、**、病原体以及受体等）。

    **酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用**动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，*好是特异性强的高效价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在**抗体上，间接法是将酶标记在**抗体上，检测细胞内的特定抗原物质。目前通常选用**酶组化间接染色法。

    **组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体，单克隆抗体是一个B**细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术**动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接**动物后，从动物血中所获得的**血清，是多个B**细胞克隆所产生的抗体混合物。

2. **细胞化学技术的临床应用

（1）恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断；

（2）确定转移性恶性肿瘤的原发部位；

（3）对某类肿瘤进行进一步的病理分型；

（4）软组织肿瘤的**一般需根据正确的组织学分类，因其种类多、组织形态相像，有时难以区分其组织来源，应用多种标志进行**组化研究对软组织肿瘤的诊断是不可缺少的；

（5）发现微小转移灶，有助于临床**方案的确定，包括手术范围的确定；

（6）为临床提供**方案的选择。

3. 细胞爬片**组化实验步骤

（1）取出细胞爬片，用PBS洗两次，每次3分钟；

（2）用4%多聚甲醛室温固定10－15分钟；

（3）用PBS洗三次，每次3分钟；

（4）滴加正常山羊血清封闭液，使一些非特异性的位点封闭起来，室温30分钟；

（5）弃去血清，滴加一抗，4℃过夜；

（6）放入PBS中洗2－3次，每次5分钟；

（7）滴加辣根过氧化酶标记的二抗，然后室温静置半小时；

（8）PBS洗2－3次，每次5分钟；

（9）加显色液DAB显色5－10分钟，在显微镜下掌握染色程度；

（10）用自来水洗终止染色20分钟；

（11）苏木精复染6－9秒，自来水冲洗10－15分钟；

（12）脱水、透明、封片、镜检。

4. 注意事项

（1）良好的细胞爬片是进行**组织细胞的基础，对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上，这样细胞爬片才较牢固，冲洗时不易脱片；

（2）接种的细胞密度要适中，以2×104/ml为宜，若细胞密度太高，5天后细胞连接成片冲洗时易脱片；

（3）细胞爬片固定后，玻片可密闭保存于4℃冰箱；

（4）冲洗时只须轻轻振荡培养皿，不可用吸管太用力吹，否则易脱片；

（5）加一抗、二抗后冲洗时**次须将玻片倾斜。

注意事项：

1.新鲜组织固定于4%多聚甲醛24h以上；

2.取材切面要平整，厚度不宜超过2mm；

3.请明确拍照部位及拍照倍数(一般为40X、100X、200X、400X)。