碧波TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(荧光法)(石蜡切片) BA2520/BA2550/BA25100

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产品型号：BA2520/BA2550/BA25100

品牌：biobox

公司名称：南京碧波生物科技有限公司

所在地：江苏南京

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产品简介

TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(荧光及显色法为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应把荧光素连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3’-OH末端，洗涤后就可以通过荧光显微镜检测到凋亡细胞。

产品详细信息

碧波TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（荧光及显色法）（石蜡切片专用）

一、产品简介

TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（荧光及显色法）(Fluorescence and Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应把荧光素连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3’-OH末端，洗涤后就可以通过荧光显微镜检测到凋亡细胞；荧光素亦可被抗荧光素抗体(anti-fluorescein antibody)标记，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈棕色），因而在普通光学显微镜下即可观察和计数凋亡细胞。

细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜检测；同时荧光素亦可被抗荧光素抗体(anti-fluorescein antibody)标记，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈棕色），因而在普通光学显微镜下即可观察和计数凋亡细胞。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被标记。这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。

本试剂盒适用于组织样本（石蜡切片）的凋亡原位检测。

本试剂盒有如下优点：

1、高灵敏度：可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。

2、特异性：TUNEL检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。

3、快速：仅需约3小时即可完成。

4、操作简单：使用Ready-to-Use型试剂，并配有蛋白酶K和DAB。

5、方便观察：可使用荧光显微镜观察实验结果，亦可在信号转换后使用光学显微镜观察实验结果。

二、试剂盒组份

组份	Cat: BA2520	Cat: BA2550	Cat: BA25100	储存条件
平衡液	1.0 mL	2.5 mL	5.0 mL	-20℃
荧光标记液	20μL	50μL	100μL	-20℃避光
TdT酶	80μL	200μL	400μL	-20℃
50×蛋白酶K	40μL	100μL	200μL	-20℃
anti-fluorescein antibody	200μL	500μL	1000μL	-20℃避光
DAB	2mg	5mg	10 mg	-20℃避光

三、试剂盒以外自备仪器和试剂

二甲苯、多聚甲醛、甲醇、乙醇、PBS、H₂O₂、TritonX-100、柠檬酸钠、复染染液：苏木素或甲基绿等；

盖玻片、载玻片、染色缸、染色湿盒、荧光显微镜、光学显微镜、37℃孵箱、移液器等。

四、保存条件：

-20℃保存，荧光标记液需避光保存。

五、注意事项：

1、TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。

2、极少数细胞凋亡时没有DNA断裂，此时不适用TUNEL法检测。在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。在需要严格判断细胞凋亡的情况下，*好同时检测多个凋亡指标。

3、使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。

4、因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心。

5、为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。

6、 TdT 酶反应液*好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。

7、DAB为固体粉末，使用前加入PBS配制成20×DAB（10 mg/ml）后，按说明书显色使用。

8、为了您的**和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

六、操作规程

A、检测样本的预处理

TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在，本说明书推荐的条件仅为普遍情况，用户需根椐自已的样

本材料及**试验结果来调整各个条件，如处理时间、处理浓度等，来优化出适合自身样本的试验条件，从而做出客观的试验结果。

1、 对于石蜡切片

a、按常规方法将石蜡切片进行脱蜡及水合

（如：二甲苯脱蜡2次，每次5-10 min；乙醇水合（将脱蜡好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min））

b、把a步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。

c、把b步处理好的样本加入蛋白酶K工作液， 21-37℃作用15-30min。

（蛋白酶K工作液的配制：2μL 50×蛋白酶 K＋98μL PBS）

d、把c步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。

e、把d步处理好的样本浸入封闭液中，室温（15-25℃）封闭10min。

（封闭液的配制： 3%H₂O₂溶于甲醇）

f、把e步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次5min。

g、然后转入B步骤标记和显色反应。

注意事项：

a、蛋白酶K处理的使用浓度、处理时间及温度，都因组织的类型不同而有所不同，需要自已摸索优化上述条件，如有问题，请根椐本说明书的《常见问题的原因及推荐解决方案》来调整条件。例如：如果凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的Proteinase K（400μg/mL）处理5分钟。（本试剂盒的50×Proteinase K浓度为1mg/mL）。

b、其它替代方法：石蜡切片的预处理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一，即蛋白酶K处理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同：

替代方法1:

将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10 min（通透液的配制：0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）

替代方法2：

将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10 min（胃蛋白酶溶液的配制：0.25%-0.5%溶于HCl PH2；胰蛋白酶溶液的配制：0.25%-0.5%溶于0.01N HCl ）

替代方法3:

将脱蜡及水合好的切片浸入含200ml 0.1M的柠檬酸缓冲液PH= 6 的塑料盒中，置于微波炉中350W（低档）处理5 min。为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。

c、使用酶处理切片时一定要把酶洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

2、对于难处理的切片

a、按常规方法将石蜡切片进行脱蜡及水合

（如：二甲苯脱蜡2次，每次5-10 min；乙醇水合（将脱蜡好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min））

b、把a步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次5min。

c、把b步处理好的样本加入浸入含200ml 0.1M的柠檬酸缓冲液PH= 6 的塑料盒中，置于微波炉中750W（**）处理1 min

d、迅速加入80ml双蒸水（20-25℃）加入c步处理好切片的塑料盒中，冷却至室温，将组织切片转移至PBS（20-25℃）中。

e、把d步处理好的样本浸入封闭液中，室温（15-25℃）封闭10min。

（封闭液的配制： 0.1M Tris-HCl PH 7.5、3%BSA、20%小牛血清）

f、把e步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次10min。

g、然后转入B步骤标记反应。

5、阳性对照及阴性对照的准备

TUNEL检测同时需要设阳性和阴性对照，以显示试验的客观性及准确性。因此需要按下述方法准备两个样本来制备阳性及阴性片，其后续步聚与待测样本同样进行。

a、阳性对照样本的准备

组织样本在蛋白酶K处理、PBS浸洗后，再加入100μL DNase I反应液（用户自备）室温～37℃处理10 -30 min，其余步骤均相同。

（DNase I反应液的配制：10u-3000u DNase I，40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl_2, 10mM CaCl₂）

b、阴性对照样本的准备

在标记反应的过程中不添加TdT酶反应液，其余步骤均相同。

B、 标记和显色反应：

1、预处理好的样本PBS漂洗2次，每次5min后，样本周围用滤纸或吸水纸吸干。

2、配制TdT酶反应液：

参考下表配制适当量的TdT酶反应液（根据需要按照比例放大），需充分混匀。注意：配制好的TdT酶反应液必须一次使用完毕，不能冻存。

	1个样品	5个样品	10个样品
平衡液	45µl	225µl	450µl
荧光标记液	1µl	5µl	10µl
TdT酶	4µl	20µl	40µl
TdT酶反应液总体积	50µl	250µl	500µl

3、每个样本滴加50μL TdT酶反应液，加盖玻片37℃避光湿润反应60min。（阴性对照片不加TdT酶）

4、把第3步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。

5、荧光显微镜下观察，可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。

可进一步用DAB进行染色观察

6、 anti-fluorescein antibody及DAB工作液的配制：

anti-fluorescein antibody工作液的配制：

参考下表配制适量的anti-fluorescein antibody工作液，需充分混匀。注意：配制好的anti-fluorescein antibody工作液必须一次使用完毕，不宜冻存。

	1个样品	5个样品	10个样品
anti-fluorescein antibody	10µl	50µl	100µl
PBS	40µl	200µl	400µl
anti-fluorescein antibody工作液总体积	50µl	250µl	500µl