三篇Nature子刊揭示CRISPR-Cas9技术新策略

在一项新的研究中，来自美国莱斯大学的研究人员发现新的基因组编辑技术更为准确，而且具有更少的脱靶(off-target)错误。这种新技术是通过改进现有的基因组编辑技术CRISPR-Cas9而实现的。利用这种新技术，研究人员在自然出版集团旗下的Molecular Therapy期刊上发表了三篇论文。

莱斯大学生物工程教授Gang Bao和他的同事们的想法是让能够切割DNA的工程核酸酶在靶标位点(on-target)上的基因编辑能力*大化。尽管几个这样的系统---如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)和CRISPR-Cas9---已被研究多年，但是过去三年来，利用CRISPR-Cas9进行基因组编辑已吸引了全世界科学家们的目光。

作为**的一种自然发生的防御系统，CRISPR-Cas9允许研究人员设计一段短的被称作向导RNA(guide RNA, gRNA)的RNA序列，gRNA能够特异性地结合到细胞中的一段DNA片段上。与gRNA组合在一起的Cas9蛋白酶然后切割这段片段，破坏它或利用模板DNA替换它。

这就是**利用CRISPR-Cas9保护自己抵抗**的方式。**接触到入侵者(如噬菌体)会导致**将入侵者的基因信息添加到CRISPR中。**然后就能识别同样的入侵者的再次入侵，并利用合适的Cas9蛋白酶摧毁它们。

大约在三年前，研究人员便已发现**CRISPR-Cas9经改造后能够编辑人细胞中的DNA，比如，以**将入侵者的DNA特征序列录入CRISPR中的相同方式，让正常的或者说野生型的序列替换突变的序列。这种技术被视为在**建模和**、合成生物学和分子通路分析中具有巨大的潜力。

但是除了在正确的位点外，CRISPR-Cas9仍然会在错误的序列(即脱靶位点)进行切割。Bao说，在**应用上，CRISPR-Cas9的脱靶切割可能导致很多有害的后果，如癌症产生。

Bao将CRISPR-Cas9描述为编辑基因的纳米剪刀。目前，他正在研究改进CRISPR-Cas9的方法。

他的目标之一就是**遗传性**镰刀贫血症(sickle cell anemia)。他希望利用CRISPR-Cas9*终**这种**。但是首先这种**方法必须更好地避免在脱靶位点进行切割以免导致不想要的副作用。

在**和**篇论文中，研究人员研究了Cas9蛋白不同的直系同源物(ortholog)，即与CRISPR/Cas9技术经常用到的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes, Spy)具有相同祖先但属于不同种属的Cas9蛋白。

Bao说，“在这两篇论文中，我们的方法就是探索使用不同Cas9直系同源物的可能性。确实存在很多可能性。”

在**篇论文中，Bao和他的团队在哺乳动物细胞开展实验来描述来自脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides, Nme)的CRISPR-Cas9系统。他说，在生物工程师降低脱靶位点编辑风险上，Nme的CRISPR-Cas9与Spy存在差别。

这种差别主要存在于不是靶位点的一部分但在靶位点附近的DNA序列上。这种序列被称作前间区序列邻近基序(protospacer-adjacent motif, PAM)，是靶DNA序列的一种标志物，也是Cas9蛋白结合所必需的。在Spy编辑中，PAM序列通常长3个核苷酸。而对Nme而言，所需的PAM序列更加长一些---8个核苷酸。根据研究人员的说法，这意味着Nme的CRISPR-Cas9很可能只有更少的结合位点，而且这些结合位点也很可能是正确的靶位点。他们声称，这可能成为一种更加**的基因编辑替代选择。

在**篇论文中，通过与来自德国弗莱堡大学的研究人员合作，研究人员利用另一种**的CRISPR-Cas9系统实现了高度特异性的人基因编辑。在这项研究中，Spy Cas9蛋白被来自嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles, Sth)的Cas9蛋白替换，其中Sth Cas9也识别更长的PAM序列。在人细胞中开展的测试发现Sth Cas9蛋白具有更为严谨的PAM序列需求因而在避免脱靶效应上比Spy Cas9表现得更好。

Bao和同事们也研究了能够存在于DNA和RNA上的影响靶向切割的凸起效应。当一段序列比gRNA特异性结合的DNA序列长或短一个核苷酸时，凸起就会出现。

他说，“我们发现即便DNA或RNA形成凸出，Cas9蛋白仍然能够切割。这是我们的研究取得的独特贡献。没有人观察这种情形，但是我们证实了这一点。也因此，我们开发出一种基于网路的工具来寻找潜在的含有错配碱基、RNA凸起或DNA凸起的脱靶位点。”

Bao注意到，不同于Spy，Nme Cas9蛋白和Sth Cas9蛋白足够小而能够被包装到腺相关病毒(AAV)中以便转运到动物的特定细胞中用于**。他说，“这是另一项优势，也是我们想继续研究这两种系统的原因。”

第三篇论文是对当前的CRISPR-Cas9技术进行综述，着重关注可获得的用于靶标选择、实验性方法和验证的基因组编辑工具。Bao和他的团队也列出仍待解决的以便消除脱靶效应的一系列挑战。

他说，他所取得的进展部分上是由于他研究两种新的**CRISPR-Cas9系统以及以下事实：在实验室中，CRISPR-Cas9比诸如TALEN和ZFN之类的其他基因组编辑系统更为容易执行。

Bao说，不同于这些较早出现的基因组编辑技术，CRISPR-Cas9更便于学生们在短时间内学习和使用。

Bao希望让他的实验室成为德州医学中心基因组编辑的焦点。为此，去年12月在莱斯大学生物科学研究合作计划(BioScience Research Collaborative, BMC)精心举办的研讨会上，他将德州医学中心基因组编辑领域的科学家们聚集在一起。

他说，“我们进行了大量讨论。我想要推动的一件事情就是将德州医学中心使用CRISPR的很多实验室之间建立一种合作关系。这些实验室需要设计CRISPR系统用于不同的目的，但是都存在许多相同的问题。如果我们携手努力，那么将会更容易解决这些问题。