琼脂糖凝胶电泳条件有哪些

琼脂糖凝胶电泳条件有哪些

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法.其分析原理与其他支持物电泳的*主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。

琼脂糖凝胶电泳条件

电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为*适。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。

琼脂糖凝胶电泳为什么会形成条带

琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法.核酸是两性电解质,其等电点为pH2-2.5,在常规的电泳缓冲液中（pH约8.5）,核酸分子带负电荷,在电场中向正极移动.核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时,具有电荷效应和分子筛效应,但主要为分子筛效应.因此,核酸分子的迁移率由下列几种因素决定：

（1）DNA的分子大小.线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶电泳中的迁移速率与DNA分子量对数成反比,分子越大则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中移动,因而迁移得越慢.

（2）DNA分子的构象.当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关.相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的,超螺旋DNA移动得*快,而开环状DNA移动*慢.如在琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA.

（3）电源电压.在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比.但是随着电场强度的增加,不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小.要使大于2kb

的DNA 片段的分辨率达到*大,所加电压不得超过5v/cm.

（4）离子强度影响.电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率.在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶）,电导率*小,DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液）,则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性.

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。