脉冲场凝胶电泳技术

PFGE技术简介：

      1984年Schwartz和Cantor发明了交变PFGE技术， 解决了大片段DNA （＞40 kb） 差异的问题， 同时提高了DNA的分辨力。此后,随着PFGE技术的不断改进,现已具有分辨出高达10Mb级DNA的能力。这一独具的高分辨力使PFGE的应用范围已涉及到几乎所有生物基因组结构的研究。

工作原理： 大小不同的DNA 分子在交替变换方向的电场中做出反应所需的时间不同， 一般较小的分子重新定向较快，在凝胶中移动快；大的DNA分子比小的DNA分子定向慢， 在凝胶中移动比较慢；根据各DNA分子迁移距离的不同从而可以达到分离不同大小的DNA 分子的目的。在所有分子分型方法中，脉冲场凝胶电泳以重复性好、分辨性强，被作为**分子分型的PFGE分型技术因其重复性好、分辩力强被誉为**分子分型技术的“金标准”,并推荐作为金黄色葡萄球菌等病原微生物分型的标准技术。

PFGE 琼脂糖的选择

      PFGE是以琼脂糖作为支持介质的电泳方法。不同支持物的PFGE其用途及作用效果不尽相同，依据不同的支持物可以将PFGE分为2种。

1．SeaKem Gold琼脂糖PFGE

         SeaKem Gold琼脂糖是一种高凝胶强度， 低电内渗 （Electric endosmosis， EEO）， 标准胶凝温度的琼脂糖。此凝胶*适于PFGE快速分辨50 kb～10 Mb的DNA和常规电泳方法分辨1～50 kb的DNA与PCR产物。因其高凝胶强度，使这种琼脂糖在浓度很低（0.5%）时容易操作；因其低EEO特性，SeaKem Gold琼脂糖中的DNA电泳迁移速度要显著高于常规琼脂糖凝胶，从而允许在常规电泳中分离更大的DNA片段并减少PFGE中DNA分离的耗时。因此，这种方法比较常用。 Lonza SeaKem® Gold Agarose（Cat# 50152，50150）

2．InCert琼脂糖PFGE

         兆碱基片段DNA制备获准使用的琼脂糖，是一种极为有用的制备PFGE用染色体DNA样品的低熔点琼脂糖。研究证实InCert琼脂糖凝胶可支持凝胶中染色体DNA的制备和限制性核酸内切酶反应。吴利先和黄文祥 参照Murray等的方法利用InCert琼脂糖进行PFGE鉴定，并获得sprE基因突变株。Lonza InCert™ Agarose（cat# 50121, 50123）。

PFGE的应用范围：

1. 微生物分子分型；

2. 细胞凋亡的检测；

3. 临床诊断和**；

4. 耐药菌株流行趋势分析；

5. ***敏感株和多重耐药菌株的分子分型。

操作步骤：PFGE的简要操作步骤包括样品的包埋、原位裂解、**酶切位点的限制性内切酶对染色体DNA的消化、脉冲场电泳、凝胶的EB染色观察5个步骤。