大肠杆菌重组蛋白纯化方法

大肠杆菌重组蛋白纯化方法

分子克隆构建载体的*终目的是能够将目的蛋白表达出来，常见的表达系 统有大肠杆菌表达系统，酵母表达系统，昆虫细胞表达系统，植物表达系统以 及哺乳动物细胞表达系统。大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、操作简单、 产量高、价格低等优点，是*常用的蛋白表达系统之一。重组蛋白的分离纯化 是蛋白，抗体，Elisa 试剂盒研发与制备的基础。常见的纯化方法有离子交换层 析，亲和层析，疏水作用层析，排阻层析，电泳等，但纯化工作不仅要保证纯 度，重复性，还要保证稳定性并控制成本。以下将以 E.coli 表达的重组蛋白为例， 给大家介绍蛋白表达成功后的纯化方法，以期对研究者蛋白纯化提供一定的参 考指导。

由于 E.coli 表达的蛋白在某些情况下会形成包涵体，它们不溶于水，致密地 集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种情况要棘手得多，另一 种情况是得到可溶蛋白。下面我们会从可溶蛋白和包涵体蛋白两个角度对 E.coli 重组蛋白纯化方法进行了解。

1. 可溶蛋白，如果蛋白是可溶的，可直接破菌，加酶抑制剂，保证蛋白充 分释放及不降解，然后选用固定化金属螯合亲和层析 IMAC 方法进行纯化。下 图是采用 IDA 镍柱进行人 AQO10 重组蛋白纯化的电泳图：

图 1 SDS-PAGE （human AQO10）

注：泳道 1 为纯化前蛋白，泳道 2 为流穿液，泳道 3 为挂柱后洗涤下来的蛋白

由图中可以看出，泳道 1 纯化前的样本杂带多，说明样本中所含杂蛋白多； 泳道 2 为蛋白纯化的流穿液，杂蛋白与泳道 1 类似，但目标蛋白的条带更深了， 这是因为目标蛋白的含量很高，洗脱下来的一些目标蛋白就占了流穿的一部分； 但可以发现泳道 3 只有一个目标蛋白的条带，无其它杂带，表明纯化之后蛋白 的纯度非常高，无杂蛋白。

2.对于包涵体蛋白，要分离包涵体、增加蛋白质的溶解度、并去除其它杂蛋 白，核酸，细胞碎片，脂类等干扰，具体操作步骤原理如下：

1) 菌体重悬，破菌。向菌体中加入破菌液使菌体混悬，加入 Triton X-100 以及 EDTA，超声破碎仪破菌。Triton 属于去垢剂分步洗涤中的**步洗涤， 可以洗涤掉一些脂溶性物质同时增加细胞膜的通透系，提高破碎效率，EDTA 作为金属蛋白酶螯合剂存在；

2) 去垢剂洗涤。这一步是为了溶解包涵体，沉淀加破菌液重悬，每管 中加入 Ttiton X-100，可进一步去除杂质，混合均匀后离心收集沉淀；

3) 高盐洗涤。这一步可去除上步残留物的干扰，沉淀加高盐缓冲液重 悬，混合均匀后离心收集沉淀。同时该浓度盐可屏蔽蛋白电荷相互作用，另 外可促进破碎释放的未断裂的核酸的溶解，方便后步核酸去除的处理。

4) 变性剂洗涤。沉淀加 Tris ，Urea，β-ME 重悬，混合均匀后收集沉 淀。低浓度变性剂 urea 可洗涤掉一些低表达的杂蛋白，EDTA 仍作为金属蛋 白酶螯合剂，β-ME 作为还原剂可使高度错配的蛋白结构一定程度的舒展 开。

5) 变性剂溶解。沉淀悬浮于 10ml 的包涵体溶解液（20mM Tris，6M GdnHCl，2mM β-ME，PH8.0）中室温静置过夜。高速离心，收集上清。 高强度的变性剂使不溶性蛋白沉淀溶解，β-ME 使错配的二硫键打开，促进 蛋白的溶解

6) 与可溶蛋白一样，采用 IMAC 固相金属离子亲和层析纯化变性充分 的重组蛋白。

图 2 SDS-PAGE （AKA4 ag7854 rat APPBP2(28a)）

泳道 1 为为流穿液，泳道 2 为挂柱后洗涤下来的蛋白

蛋白会通过洗脱收集验证。由图可以看出，包涵体蛋白的纯化与可溶性蛋 白的纯化效率都非常高。

蛋白纯化之后，首先我们会通过 SDS-PAGE 对蛋白以及纯度进行一个初步 验证，同时通过 HPLC 对纯度进一步验证，保证纯度大于 95%以上。

蛋白质的纯化方法主要是利用不同蛋白质之间的相似性与差异，依据蛋白 之间的相似性可以去除非蛋白物质，再根据蛋白质的差异性将目的蛋白分离出 来。蛋白纯化是一项非常复杂的工作，我们提供常规 E.coli 表达的重组蛋白纯化 方法供研究者参考。