产品名称：人剪切修复交叉互补修复缺陷偶联因子1(ERCC1)检测试剂盒

        人剪切修复交叉互补修复缺陷偶联因子1(ERCC1)检测试剂盒使用说明书

（本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断!）

声明：尊敬的客户，感谢您选用本公司的产品。本产品适用于体外定量检测人血清、血浆或其它相关生物液体中剪切修复交叉互补修复缺陷偶联因子1(ERCC1)浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分！ 

灵敏度、检测范围、特异性和重复性:

●灵敏度：*小可测0.065ng/mL

●检测范围：0.156-10ng/mL

● 特异性：可检测重组或天然的剪切修复交叉互补修复缺陷偶联因子1(ERCC1)，且与其它相关蛋白无交叉反应。

● 重复性：板内，板间变异系数均<10%。

人剪切修复交叉互补修复缺陷偶联因子1(ERCC1)检测试剂盒组成：

特别说明：

*: [96T/48T]（打开包装后请及时检查所有物品是否齐全完整）

#: 一周内使用可存于4℃，需长时间存放或多次使用建议存于-20℃.

相关试剂在分装时会比标签上标明的体积稍多一些，请在使用时量取而非直接倒出！

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗剪切修复交叉互补修复缺陷偶联因子1(ERCC1)抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的剪切修复交叉互补修复缺陷偶联因子1(ERCC1)会与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗剪切修复交叉互补修复缺陷偶联因子1(ERCC1)抗体和 辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗剪切修复交叉互补修复缺陷偶联因子1(ERCC1)抗体与结合在包被抗体上的剪切修复交叉互补修复缺陷偶联因子1(ERCC1)结合、生物素与亲和素特异性结合而形成**复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根 过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，剪切修复交叉互补修复缺陷偶联因子1(ERCC1)浓度与OD₄₅₀值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中剪切修复交叉互补修复缺陷偶联因子1(ERCC1)的浓度。

人剪切修复交叉互补修复缺陷偶联因子1(ERCC1)检测试剂盒样品收集:

1.血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集 血液的试管应为一次性的无热原，无内**试管。

2.血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na2，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可 检测。避免使用溶血，高血脂样品。

3.组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会 影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体 积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。 推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组 织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。*后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟， 取上清检测。

4.细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

5.其它生物样品：1000×g离心20分钟，取上清即可检测 具体处理方法可参考：

6.样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻 存于-20℃(1个月内检测)，或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融。

8.如果您的样品中检测物浓度高于标准品*高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释（建议先 做预实验，以确定稀释倍数）。

人剪切修复交叉互补修复缺陷偶联因子1(ERCC1)检测试剂盒试验所需自备物品:

1.酶标仪(450nm波长滤光片)

2.高精度移液器，EP管及一次性吸头：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL

3.37℃恒温箱，双蒸水或去离子水

4.吸水纸

检测前准备工作:

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)。未用完的放回4℃。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结 晶，属于正常现象，可用40℃水浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超 过50℃，使用时洗涤液应为室温）。当日使用。

1.使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温(18-25oC)，试剂不能直接在37oC溶解。

2.标准品(冻干品)：每瓶标准品加入标准品稀释液1mL，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为10ng/mL。准备7个稀释标准品的EP管，每个EP管中加入150μL的标准品稀释液，如图所示依次倍比稀释成不同的梯度,标准品稀释液(0pg/mL)直接作为空白孔。人剪切修复交叉互补修复缺陷偶联因子1(ERCC1)检测试剂盒为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

4.生物素化抗体工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多配 制100-200μL。使用前15分钟，以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:100)成工作 浓度。当日使用。

5.酶结合物工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多配制 100-200μL。使用前15分钟，以酶结合物稀释液稀释浓缩HRP酶结合物(1:100)成工作浓度。 当日使用。

人剪切修复交叉互补修复缺陷偶联因子1(ERCC1)检测试剂盒标准品稀释方法图例：（以500μL/管为例，也可根据实际用量来稀释，如150μL/管）

洗涤方法:

1.自动洗板机：每孔加入洗涤液100μL，注入与吸出间隔60秒。

2.手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350μL，浸泡1-2分钟，吸 去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。

操作步骤:

实验开始前，各试剂均应平衡至室温；试剂或样品配制时，均需充分混匀，并尽量避免起泡。

1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品*终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。   

4.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

12.实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存。

注意事项：

1.保存：试剂盒中各试剂请按说明书提示合理存放。在储存及温育过程中避免将试剂暴露在强 光中。所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染，否则可能会出现错误的结果。

2.酶标板：刚开启的酶标板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成 任何影响。暂时不用的板条应拆卸后放入备用铝箔袋，按推荐温度存放！

3.加样：加样或加试剂时，**个孔与*后一个孔的加样时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预温育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。每次的加样时间*好控制在 10分钟内。推荐设置复孔。

4.人剪切修复交叉互补修复缺陷偶联因子1(ERCC1)检测试剂盒温育：为防止样品蒸发，实验时必须给酶标板覆膜；洗板后应尽快进行下步操作，避免酶标 板处于干燥状态；严格遵守给定的温育时间和温度。

5.洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在吸水纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸 水。在读数前要注意**底部残留的液体和手指印，以免影响酶标仪读数。

6.试剂配制：Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate体积较 小，运输过程会使液体沾到管壁或瓶盖，因此使用前1000转/分离心1min，以使附着管壁或瓶 盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。标准品、生物素化抗 体工作液、酶结合物工作液请根据所需用量配制，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请 **配制标准品及工作液，尽量不要微量配制（如吸取Concentrated Biotinylated Detection Ab时，一次不要小于10μL），以避免由于不准确稀释而造成浓度误差；请勿重复使用已稀释 过的标准品、生物素化抗体工作液、酶结合物工作液。若需要分次使用标准品应按照每一次 用量分装，将其放在-20～-80℃贮存。避免反复冻融。

7.显色时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如每隔5分钟），如梯度已很 明显，请提前加入终止液终止反应，避免颜色过深影响酶标仪读数。

8.底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。

9.混匀：充分轻微混匀对反应结果尤为重要，*好使用微量振荡器(使用*低频率)，如无微量 振荡器，可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。

10.**：试验中请穿着实验服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液样品 时，请按国家生物试验室**防护条例执行。

11.人剪切修复交叉互补修复缺陷偶联因子1(ERCC1)检测试剂盒不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）

12.试验中所用的EP管和吸头均为一次性使用，严禁混用，否则将影响试验结果！

结果判断:

1.每个标准品的OD值减去空白孔的OD值后作图，如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线。亦可以OD值为横坐标，标准品的浓度为纵坐标，绘出标准曲线。

2.推荐使用专业的曲线制作软件，如curve expert 1.3或1.4，在软件界面既可根据样品OD值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；亦可将样品的OD值代入标准曲线的拟合方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

3.若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

操作概要：

1.实验前标准品、试剂及样本的准备；

2.加样（标准品及样本）50μL，37℃孵育30分钟；

3.洗板5次，加酶标试剂50ul，37℃孵育半小时；

4.洗板5次；加入显色液A，B各50ul,37℃孵育显色15分钟

5.加终止液50μL，立即450nm读数。

6.计算