产品名称：2×Hieff™ HS Pfu Master Mix

2×Hieff™ HS Pfu Master Mix

产品描述

2×HieffTM HS Pfu Master Mix是即用型的PCR预混合溶液，包含HieffTM HS Pfu DNA Polymerase，dNTP以及优化的缓冲体系，只需加入引物和模板即可进行扩增，大大简化实验的操作步骤，提高了高通量操作和实验结果的重现性。体系中含有的保护剂使得Master Mix 经过反复冻融后仍可维持稳定的活性。PCR产物为平末端。

10116-A

2×HieffTM Pfu Master Mix

1 ml

1 ml×5

10116-B

超纯水（PCR Grade）

1ml

1 ml×5

2×Hieff™ HS Pfu Master Mix运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。收到产品后放到-20 ºC保存。

质量控制

核酸外切酶残留检测：20 μl本品和0.6 μg λ-Hind Ⅲ在74 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。

核酸内切酶残留检测：20 μl本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在74 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。

大肠杆菌残留DNA检测: 50 μl体系中，以ddH2O为模板，扩增E.coil 16s rDNA基因。35个循环后扩增产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，无扩增条带。

功能检测1：以100 ng人基因组DNA为模板扩增α-1-antitrypsin基因。30个循环后取10% PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察到单一的8.2 kb条带。

功能检测2：以10 ng λDNA为模板扩增30个循环，取10% PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察到单一的15 kb条带。

2×Hieff™ HS Pfu Master Mix应用实例

1.        反应体系配制：

ddH2O

Up to 50 μl

模板DNA§

optional

引物1(10 μM)

2 μl

引物2(10 μM)

2 μl

2×HieffTM HS Pfu Master Mix

25 μl

注：§ 针对不同模板的*佳反应浓度有所不同，下表为50μl反应体系推荐模板使用量，仅供参考。

模板种类/扩增长度

＜1 kb

1 kb～10 kb

＞10 kb

基因组DNA

50 ng～250 ng

100 ng～300 ng

150 ng～400 ng

2×Hieff™ HS Pfu Master Mix质粒或病毒DNA

10 pg～20 ng

10 pg～20 ng

1 ng～30 ng

cDNA

1～5 μl(不超过PCR反应总体积的1/10)

2.        一般PCR反应条件设置：

循环步骤

温度

时间

预变性a

95℃

30 sec～3 min

变性b

95℃

5～10 sec

25～35循环

退火c

45℃～72℃

10～30 sec

延伸d

72℃

15～30 sec/kb

彻底延伸

72℃

5～10 min

注：a. 推荐大多数模板的预变性温度为95℃， 时间为：质粒或病毒DNA，30 sec，基因组2 min，cDNA 3 min；对于高GC含量模板，预变性温度需提升至98℃，变性时间为2～4 min；对于超过10 kb的扩增子，预变性温度需降低至92℃，变性时间不超过2 min。

b. 对于大多数模板在95℃变性时间设为5～10 sec即可。对于高GC含量模板，变性温度需提升至98℃；对于超过10 kb的扩增子，变性温度需降低至92℃，并延长变性时间至15 sec。

c. Pfu DNA Polymerase能够促进模板和引物高效退火。一般来说，退火温度设置为引物Tm值±3℃范围内之间即可。如果需要，可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的*适温度。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状。因此，推荐退火时间设置为10 sec即可。对于一些困难模板，退火时间可在10～30 sec之间调整。

d. 对于大多数扩增反应，延伸过程可在72℃进行。对于超过10 kb的扩增片段，需降低延伸温度至68℃。延伸时间取决于扩增片段的长度和模板的复杂性。使用质粒等复杂程度较低的DNA做模板时，可使用15 sec/kb的延伸时间；使用基因组, cDNA等复杂程度较高的DNA做模板时，延伸时间应为30 sec/kb。太长的延伸时间会导致非特异性扩增增加，因此延伸时间请勿超过30 sec/kb。

3.        长片段PCR指南：

*使用高质量的模板；

*使用长引物。将引物加长至Tm值68～72℃，把退火/延伸温度合并为68℃。这样可以显著提高扩增特异性；

*推荐反应条件设置：

循环步骤

温度

时间

预变性

92℃

2 min

变性

92℃

5～10 sec

25～35循环

延伸

68℃

15～30 sec/kb

彻底延伸

68℃

5～10 min

4.        高GC含量模板PCR指南：

*使用高质量的模板；

*提高变性温度至98℃；

*推荐反应条件设置：

循环步骤

温度

时间

预变性

98℃

3 min

变性

98℃

10 sec

25～35循环

退火

45℃～72℃

10～30 sec

延伸

72℃

15～30 sec/kb

彻底延伸

72℃

5～10 min

2×Hieff™ HS Pfu Master Mix引物设计注意事项

1）引物3’端*后一个碱基*好为G或者C；

2）引物3’端*后8个碱基应避免出现连续错配；

3）引物3’端尽量避免发夹结构出现；

4）引物的Tm值调整至55℃-65℃之间。

5）引物额外附加序列，即与模板非配对序列，不应参与引物Tm值计算；

6）引物的GC含量控制在40%-60%之间；

7）正向引物和反向引物Tm值以及GC含量尽可能一致。