间接ELISA与直接ELISA类似，但主要区别在于引入了第2偶联抗体来检测结合抗体。实验步骤仍然从抗原固定开始，通过添加一种封闭试剂防止结合抗体的非特异性结合。
实验步骤：
步骤一：抗原固定化：将抗原固定在微孔板上，是实验的第1步。
步骤二：添加封闭试剂：防止结合抗体的非特异性结合，维护实验的特异性。
步骤三：添加抗原特异性结合抗体：加入能够与目标抗原结合的抗体，并经短暂孵育后，通过洗涤去除多余试剂。
间接检测：引入第2抗体来检测第1结合抗体。这种抗体通常与某种酶偶联。在酶底物的作用下，短暂孵育后，使用读板机测定每个孔的信号。
间接法优缺点：
1、优点：
1）、可以在一个物种中制备多个一抗，并且使用相同的标记二抗进行检测。
2）、保留了第1抗体的大免 疫反应性。
3）、高标记的二抗密度可实现高灵敏度，导致信号放大。
2、缺点：
1）、二抗可能发生交叉反应，导致非特异性信号。
2）、过程中需要额外的孵育步骤，增加实验时间。