MTT检测|实验技术服务

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MTT检测|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
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测序实验流程：
MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4，5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3，5-di- phenytetrazoliumromide， MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原)。还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。
1、接种细胞
用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。
2、培养细胞
同一般培养条件，培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。
3、呈色
培养3-5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS 配)20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。
4、比色
选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
二、注意事项
1、选择适当得细胞接种浓度。
2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，*后比色以空白调零。
MTT实验吸光度*后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，
IC50是半抑制率，意思是抑制率50%的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50%抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可!