酵母双(单)杂交cDNA文库构建技术服务|实验技术服务

关键词:酵母双(单)杂交cDNA文库构建技术服务|实验技术服务
简介：世界****酵母双(单)杂交cDNA文库构建技术服务|实验技术服务原装**，质量保证,价格优惠。
酵母双(单)杂交cDNA文库构建技术服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
我们具备丰富的蛋白表达设计经验及实验操作技巧，承诺客户不成功不收费。我们所有的实验数据真实可信，我们提供原始的表达菌株和克隆质粒，客户可以依据我们的实验报告重复我们的实验结果。
产品品牌：酵母双(单)杂交cDNA文库构建技术服务|实验技术服务   http://www.shijichina.com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
测序实验流程：
原理
酵母双杂交技术产生以来，它主要应用在以下几方面：(1）检验一对功能已知蛋白间的相互作用。(2）研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域。(3)用已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA文库，以研究蛋白质之间相互作用的传递途径。(4)分析新基因的生物学功能，即以功能未知的新基因去筛选文库。
ProQuest系统依靠报告基因的转录激活来鉴定蛋白相互作用。将一个基因克隆到'诱饵'载体，pDEST32，并和GAL4蛋白的DNA结合域（DBD）表达为融合蛋白。将**个基因或者编码可能的相互作用子蛋白的cDNA文库克隆到'猎物'载体，pDEST22，同GAL4的转录激活域（AD）表达为融合蛋白。当两个蛋白相互作用时，AD和DBD间距离被拉近，从而激活报告基因的表达
服务流程
1) 提取总RNA，分离mRNA，反转录cDNA。
2) 将cDNA与pDONR222载体进行BP重组反应，重组产物转化DH10B感受态细胞。
3) 甘油保存大肠杆菌文库。
4) 提取大肠杆菌文库质粒DNA，制备酵母感受态细胞
5) 大肠杆菌文库质粒DNA转化酵母菌，测定转化效率，
6) 收集酵母转化子，测定文库效价。
7) 甘油保存酵母菌文库。
使用优点： 在拥有相关组织基因文库的情况下
1 ）    可以用来比对病变组织更快的找到突变基因或者导致变异的蛋白，更快的找到攻克方向。
2 ）    可以用作大规模的蛋白筛选，在较短时间内对找到某些药物对相关组织主要的作用蛋白，对于药物的修饰和改进明确方向。
3 ）    可以反复使用，培养时间短，适合大规模筛选使用。
4 ）    作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
5 ）    检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
试验步骤:
1. Total RNA 量不要多于1mg，用移液器取出所需RNA量到1.5ml离心管中，加RNase-free water 补足到500ul
2. 根据表3加入适当体积的OBB Buffer和Oligotex Suspension， 轻弹1.5ml离心管彻底混匀
3. 置于70℃水浴中3min
4. 取出置于室温(20℃-30℃)10min
5. 13000rpm室温离心 2min，用移液器吸出上清到一个新的1.5ml离心管中，保留上清直到polyA被结合上。
6. 用移液器取400ul OW2 Buffer混匀沉淀物，将混合物转移到 Spin Column中，RT ，13000rpm，离心1min
7. 将Spin Column 转移到一个新的1.5ml离心管中，加400ul OW2，RT， 13000rpm，离心1min
9. 取出25ul OER Buffer(70℃)到Column中，用移液器吹打3-4次树脂，室温 13000rpm，离心1min。
10. 测OD,并电泳定量。
cDNA构建成功关键因素 
1.  保证获得数量足够的高质量的起始RNA
2.  反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键
3.  层析柱cDNA分级很关键