凝胶迁移或电泳迁移率(EMSA)服务|实验技术服务

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凝胶迁移或电泳迁移率(EMSA)服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
我们具备丰富的蛋白表达设计经验及实验操作技巧，承诺客户不成功不收费。我们所有的实验数据真实可信，我们提供原始的表达菌株和克隆质粒，客户可以依据我们的实验报告重复我们的实验结果。
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测序实验流程：
其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后（如下图所示）。该方法可用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白，并可通过加入特异性的抗体（supershift）来检测特定的蛋白质，并可进行未知蛋白的鉴定。 
1. 制胶 必须是非变性PAGE凝胶,我们实验室一般用6.5%的非变性胶.制胶很重要,直接影响电泳的效果!一般控制在5分钟凝固的效果.
10X TBE 1.0ml
40% Acrylamide（40%聚丙烯酰胺） 3.3ml
50% Glycerol（50%甘油） 1.0ml
dH2O（蒸馏水） 14.8ml
TEMED（四甲基乙二氨） 20µl
脱气10min
10% AP（过硫酸氨） 120µl
总量 20.0ml
2. 一般试剂盒包括的试剂
l 10X Binding Buffer（10X 结合反应液）(-20 oC)
l Poly (dI:dC) (dI:dC)（聚核苷酸竞争物）(-20 oC)
l 6X Loading Buffer（10X 上样缓冲液）(4 oC)
l Cold oligonucleotides（非标记竞争性寡核苷酸）(-20 oC)
l Biotin-Labeled Probe（生物素标记探针）(-20 oC)
l Streptavidin-HRP（链霉亲核素-HRP）(4oC)
l 2×Blocking Buffer（2× 封闭液）(4 oC)
l 5×Washing Buffer（5× 洗涤液）(4 oC)
l Equilibration Solution（平衡液）(4 oC)
l Binding-membrane（结合反应膜）(RT)
3. 结合反应
每次结合反应需1-5µl核蛋白(根据核蛋白浓度而定)，根据不同的核提取物浓度加入核提取物用量，用双蒸蒸馏水将终体积调节到15µl
（1） 结合反应体系：
10X 结合反应液 1.5µl
Poly(dI:dC)(dI:dC) 1.0µl
细胞核提取物* ? µl
双蒸水* ? µl
混匀室温静置20 分钟
生物素标记的探针 0.5µl
总量 15µl
混匀室温静置20分钟或以上。
（2）特异性反应确认竞争反应体系：
10X 结合反应液 1.5µl
Poly(dI:dC)(dI:dC) 1.0µl
细胞核提取物 ? µl
未标记的竞争性寡核 2.0µl
双蒸水* ? µl
混匀室温静置20 分钟
生物素标记的探针 0.5µl
总量 15µl
混匀室温静置20分钟或以上。
其中:
探针用量: 这相当于10-50fmoles的DNA探针。我们通常是*少50fmol.
蛋白样品用量: 一般用量在2---20ug(控制在1-5µl)蛋白, 总体系15ul. 细胞核抽屉物浓度都比较低,组织的一般都比较高,因为杂蛋白较多.