探针合成服务|实验技术服务

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探针合成服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
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测序实验流程：
1、  合成cDNA步骤
（1）    加入从卵巢癌细胞或组织中提取的总RNA ≥ 5ug。
（2）    加入 Nuclease-free 水 75 ul
（3）    加入 5x iScript Reaction Mix，按20 ul/ 100ul 比例加入。
（4）    加入 iScript RT，5 ul.
（5）    在pcr仪上，按以下步骤进行加热：
5 minutes at 25°C；30 minutes at 42°C；5 minutes at 85°C。
储存在 –20C冰箱。
2、  扩增ERCC2目的片段
（1）   订购ERCC2引物，序列如下：
F：5'-CCGctcgagGCTCCTGGTCTACTTCCCGTACG-3'
R：5'-ATTTgcggccGCACGCAGCCGCCACTTCACGTAC-3'
（2）   准备反应液：
按以下试剂比例进行反应MIX的配置：
10x reaction buffer                            5 ul (1x)
dNTPs (stock 10 mM)                            1.0 ul (200uM
Forward primer (250uM)                        1.0 ul (0.2 uM)
Reverse primer (250 uM)                     1.0 ul ( 0.2 uM)
cDNA template                             1 ul  (1 ug)
Taq PCR Polymerase enzyme                  0.5 ul
ddH20                                        up to     50 ul
Total                                                50 ul
（3）   PCR 反应过程
1)        准备PCR仪，并检查是否可用。
2)        打开PCR仪顶盖，将96PCR板放置在加热模块上盖紧顶盖；
3)        选择程序如下：
1cycle：94’C，3 min  
35 cycles： 94’C，30s；62’C，1 min；72’C，1.5 min             
1cycle：72’C，7 min；4’C    forever
（4）   配制琼脂糖凝胶：
1)   取出干燥的铺胶板。
2)   称取2.5g 的琼脂糖，放入250ml 的容量瓶中，用量筒量取250ml 的1x TAE 加入容量瓶中，轻轻摇晃2－3 下。
3)   将盛有TAE 和琼脂糖的容量瓶放入微波炉中，高火加热4min。
4)   小心取出，室温冷却5－10min，稍微摇晃混匀，待溶液温度冷却到60℃（不烫手为宜），混匀。
5)   将琼脂糖溶液倒入事先准备胶槽中，将梳子放置在胶槽上，室温避光放置30min 左右。
6)   待凝胶干燥后备用。