Michael Kirchgesser*,Sabine Eppler,Christel Adem,Sabine Mitzel,Werner Malmberg,Claudia Kappelsberger,Louise Zieseniss,Peter Wenzig
Roche Applied Science,Penzberg,Germany
*通讯作者:michael.kirchgesser@roche.com
前言
现在有许多用于核酸分离的——人工和自动——试剂盒和方法。但是,其中很少能保证全自动的样品制备,同时保证*高回收率和灵敏度。因此罗氏诊断公司开发了全新的MagNAPure LC总核酸分离试剂盒-High Performance。这种试剂盒基于经典的磁珠分离技术,后者成功用于不同的MagNAPure自动核酸分离纯化系统已有多年。这个新试剂盒通过技术优化,保证了总病毒DNA和RNA从血浆、血清和全血中的极高回收率,从而适用于高灵敏度的病毒核酸检测。此外,它使可处理的样品量范围达到100-1000μl。并且,如果需要的话,还有外部裂解方法可供选用,从而允许在MagNAPure LC仪器之外进行病毒灭活。
材料和方法
新试剂盒是用人EDTA血浆、枸橼酸盐血浆、血清和全血作为样品材料开发的。本研究中,在样品中添加不同量的DNA病毒(巨细胞病毒、EB病毒)和RNA病毒(甲型肝炎病毒、甲型流感病毒),并在MagNAPure LC仪器及对照平台上进行处理。所有样品至少以4倍复制进行试验。纯化核酸的洗脱体积为50或100μl。对上述4种病毒类型,采用参数特异的定量实时PCR和RT-PCR分析,在LightCycler?480实时荧光定量PCR系统上进行分析。用15μl各种预混液和5μl各种洗脱液建立扩增反应,并运行45个周期。
结果和讨论
所有试剂盒组成部分都进行了优化,对不同试剂组成进行了试验,更改了所有的处理步骤和反应条件以寻找*佳的总核酸(TNA)分离程序。新方法兼容MagNAPure LC 1.0仪器和*新的MagNA Pure LC 2.0仪器。
灵敏度/阳性率
实验结果显示,达到*高的灵敏度需要非常充分的结合步骤,这就需要相对长的运行时间(32份样品需要180分钟)。这种“高灵敏度(总NAHS)方法”允许对于每次分离检测低于100个病毒拷贝数(用200μl样品量),理论上相当于每次(RT-)PCR可检测低于10个拷贝。这种方法在我们的灵敏度试验中显示良好的结果(表1),与当前实验室中*好的对照系统相似,甚至更好。
但对于许多应用,这种*高灵敏度不是必需的,因此我们也开发了一种耗时较短的“高性能(总NAHP)方法”,即灵敏度稍低,但速度快得多(32份样品需90分钟)。
表1:新的“总NA HS”和“总NAHP”方法以及对照系统之一的阳性率。对于阳性率试验,将大约为检测极限的病毒量加入24份样品。在核酸分离和检测后,计算PCR阳性洗脱液(“阳性”)的百分比。括号中是每份样品中加入的大约病毒拷贝数,注意病毒滴度的测定通常具有一定不**性。
分离方法 | HAV | Inf.A | EBV | CMV |
| (66 个拷贝) | (50 个拷贝) | (200 个拷贝) | (100 个拷贝) |
“总NA HS 200” | 100 % | 100 % | 79.2 % | 91.7 % |
“总NA HP 200” | 100 % | 100 % | 33.3 % | 83.3 % |
对照方法B | 91.7 % | 91.7 % | 62.5 % | 91.7 % |
回收率
为了比较新试剂盒与当前*佳对照方法的回收率,用大约每份样品104个拷贝的“中等”病毒浓度对新的“总NA HP”、“总NAHS”方法,以及对照方法B进行并行运行。结果与阳性率实验相似:新的试剂盒和方法显示了**的性能(图1),尤其总NAHS方法与当前实验室中*好的对照系统相似甚至更好。
图1:不同样品类型的病毒核酸回收率。举例显示了HAV和EBV的结果。新的“总NA HS”和“总NAHP”方法的分离效率与*佳对照方法相似。柱状图显示了通过定量(RT-)PCR计算的分离拷贝数差异。每个柱形显示了4倍复制的平均值。在所有情况下,“总NAHS”方法或与对照方法处于相同范围,或显著优于对照方法。
交叉污染试验
用16份阳性和16份阴性血浆样品,排列成棋盘图形,对新的试剂和方法进行交叉污染检查。阳性样品中加入含ParvoB19特异性序列的质粒,*终浓度为1x107和2.5x108个质粒/ml。在MagNA Pure LC 1.0仪器和MagNAPure LC 2.0仪器上进行分离。用两种MagNA PureLC仪器上的自动分析设置对洗脱液进行分析,然后在LightCycler? 480系统上进行敏感性ParvoB19特异性PCR试验,均未发现交叉污染。
大样品量方法
新试剂盒能处理100、200、500和1,000μl的样品量。试剂量允许对100或200μl样品进行288次分离,500μl样品进行192次分离,1,000μl样品进行96次分离。500和1,000μl样品的方法只适用于血浆或血清,而不适用于全血,因为血细胞中含有大量的基因组DNA。
结论
本研究显示,全新的MagNA Pure LC总核酸分离试剂盒- HighPerformance允许从多种样品材料中对总病毒核酸进行全自动高效分离,具有高回收率和灵敏度。用户可以根据特殊需要在几个不同方法间作出选择。此外,灵活的试剂概念可以处理大范围的样品量,因此这种新试剂盒的上市将成为感染性**自动分析环节中的有效工具。