实验外包-real-time PCR引物设计原则
在NCBI找到你要的基因序列,以CDS区进行引物设计。
参照以下real-time PCR引物设计原则:
1.*好位于编码区5’端的300-400bp区域内,可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。
2. 产物不能形成二级结构(自由能小于58.61KJ/mol)。
3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。
4.G+C含量在40%~60%之间,45-55%*佳。
5.碱基要随机分布,尽量均匀。
6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。
7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。
8.引物5′端可以修饰。
9. 3’端不要以A结尾,3′端不可修饰,而且要避开AT,GC rich的区域,避开T/C,A/G连续结构(2-3个)。
10. 引物3′端要避开密码子的第3位。
11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端,且3‘端自由能*好小于9KJ/mol。可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。
12.做荧光定量产物长度80-150bp*好,*长是300bp.
13.引物设计避免DNA污染,*好跨外显子接头区。
14.引物与非特异性扩增序列的同源性*好小于70%或者有8个互补碱基同源。
15.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列,与需要扩增的目的片段长度相似。
16.TM值在55-63度之间。
17. .引物与非特异性扩增序列的同源性*好小于70%或者有8个互补碱基同源。
实验外包-real-time PCR引物设计原则
正在着手做real-time PCR的朋友们,我想*开始肯定要考虑引物设计的问题。
看完下面的文字,我保证你得到想要的引物设计方法和引物序列。
**步:拿到你所要研究的基因的序列。不要告诉我你不会找序列。如果真的不会,请参考丁香园内其他版块,如NCBI使用,序列查找等。
**步:确定你想用哪种方法。Taqman Probe还是SYBR染料?两种方法各有利弊,这里不赘述,不明白的依然参见其他版块。但需要指出的是,后者在国内更常用,因为比较简单,容易操作,容易分析。建议初学者选择。
第三步:动手设计引物了!
1)两种引物设计软件。在设计real-time PCR引物时,常用的有非常NB的primer premier 5.0和primer express 3.0(升级版有5.0)。前者可以应用与常规PCR和real-time PCR;后者是ABI公司的real-time PCR仪器配套的引物设计软件,专门为real-time PCR设计。
2)选择哪个软件合适?在**步中,我已经说过,你要先确定你选择哪个方法。如果你想用Taqman Probe法,请你选择primer express 3.0。如果你想用SYBR法,我建议你选primer premier 5.0。为什么?请你往下看。
3)两种引物设计软件之比较。先说专门为real-time PCR定制的primer express 3.0。这个软件其实是为Taqman探针法设计的,而不适合SYBR染料法。如果你用探针法,强烈推荐。打开软件就会发现,在方法选择的下拉菜单中,都是Taqman探针法,没有染料法。结果导致,在你进行引物遴选的时候,都要考虑到“位于上下游引物之间的探针,以及探针与上下游引物的联系”!*终把条件限制的很窄。而染料法相对于探针法,条件相对宽泛。*终,你得不到满意的染料法的引物。在升级版中,是否有解决,我不知道,也没用过升级版。
由于primer express 3.0的局限性,使得采用染料法的朋友们,不得不求助于primer premier 5.0。具体使用方法可以在论坛里搜索。但是,需要一些遴选条件。见下面的附件。
第四步:如果你比较懒,自己又学不会用软件。那么,请你求助有强大的google和百度。搜索模式:A(你所关注的基因名称)+B(real-time PCR)google 或A(你所关注的基因名称)+C(荧光定量PCR)百度。然后下载那篇文章,找到你要的序列的引物。
第五步:如果没有人比你更懒,那么,请你在丁香园的引物板块寻找你的引物是否有人提供到数据库了,如果找不到(相信大部分找不到),那你发帖求助。
第六步:我把我找到的,验证比较好的β-antin 荧光定量PCR引物和GAPDH荧光定量PCR引物(SYBR法)分享。大家参考。
实验外包-real-time PCR引物设计原则
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