实验外包-Real-Time PCR实验流程
荧光定量PCR实验流程
实验试剂
Total RNA Kit ：Omega：(Cat.No．R6834)
First Strand cDNA Synthesis Kit：GeneCopoeia(Cat.No．C0210A)
2xAllinOneTMQ-PCRMix：GeneCopoeia（cat.No．D0101A)
Primer synthesis：invitrogen
实验设备
Real Time PCR：ABI
实验材料
样品为5个人源的细胞培养液，其编号分别为：NO.I、No.2、No.3、No.4、No.5，其中No.1为对照组，其它四个为不同的样品组。
实验步骤
1. RNA抽提
1) 样品处理：取适量样本加入 1ml TRK 裂解液匀浆样品。室温 14,000 × g 离心 5 min去除不溶解的的杂质，小心转移上清至 1.5ml 离心管。
2) 加入等倍体积 70% 乙醇至裂解液中，抽打或涡旋混匀。
3) 将柱子套在收集管中，转移混合液至柱子中。室温 10,000 × g 离心 30-60 秒，弃去滤液。
4) 把柱套放新收集管中，加入 300ul RNA Wash Buffer I 至柱子上，按以上条件离心，弃去滤液。把柱套放回收集管中。
5) DNase 消化: 配制 DNASE 消化液( Digestion Buffer, 73.5ul ; RNase-Free DNase I,1.5ul) ,混匀, 将消化液转移至柱子膜的正中央，室温静置 15 分钟。
6) 加 500ul RNA Wash Buffer I 至柱子，按以上条件离心，弃滤液。
7) 把柱套放回收集管中，加 500ul RNA Wash Buffer II 至柱子上，按以上条件离心，弃滤液。
8) 把柱套放回新收集管中，加 500ul RNA Wash Buffer II 至柱子上，按以上条件离心，弃滤液。
9) 把柱套放回收集管中， 10,000xg 离心空柱 2min 以甩干柱子基质。
10) 把柱子装在 1.5ml 离心管上，加入 30-100ul DEPC Water 柱子基质上，室温静置 2min 。10,000xg 离心 1min 洗脱出 RNA 。
11) RNA浓度测定
吸取lul抽提的RNA用DEPC水稀释10倍后．在Nanodrop上测定RNA浓度，以DEPC水做空白对照，同时记录RNA浓度及其OD260／OD280。
2. RNA电泳检测
1) 变性胶制备
取1gAgarose 75ml去离子水煮沸，冷却至70℃左右加入10ml 10×Mops和15ml 甲醛及EB。倒胶至宽口梳子的胶板上，盖上盖子。
2) 电泳缓冲液配制(1×Mops)
取50ml 10×Mops。用去离子水稀释至500ml，倒入电泳槽中，再在电泳缓冲液中添加EB。
3) RNA样品处理
取RNA 样品3u1．10×Mops 2u1．*后补充DEPC 水至20ul，65℃变性10min 后立即冷却．加入2ul 10×RNA loadingbuffer即可电泳。
4) RNA电冰
先把RNA 胶放入电泳槽中，100V 作用电泳约5min，再在点样孔中点入处理过的RNA 样品，100V左右电泳至溴酚蓝至胶的2／3处，取胶拍照。
3. 反转录
1) 融解反应所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，进行短暂离心后放置冰上待用。
2) RNA-Primer Mix的配制反应（所有反应液的配制都在冰上操作）在预冷的RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积13μl。
试剂组分 体积 终浓度
Total RNA 1μg
60μM Oligo（dT）18 1μL 2.4μM
DEPC 水 至总体积13μl
3) RNA变性
混匀RNA-Primer Mix，进行短暂离心，65℃变性10min后立即放置冰上。
4) 配制反转录反应液
在RNA-Primer Mix反应管内加入以下试剂至总体积25μl。
试剂组分 体积 终浓度
RNA-Primer Mix 13μl
5×RT Reaction Buffer 5μl 1×
25mM dNTP 1μl 1mM
25U/μl RNase Inhibitor 1μl 1U/μl
200U/μl M-MLV RTase 1μl 8U/μl
DEPC水 4μl
总体积 25μl
5) 反转录反应
混匀反应Mix，短暂离心后42℃孵育1h。
6) 灭活并保存反转录产物
反应结束后，85℃灭活处理5min，*后-20℃保存反转录产物。
4. 定量PCR实验
采用染料法（SYBR Green I）进行相对定量分析，实验设计是按照ΔΔCt解析法来进行设计。实验步骤如下：
1) 将2XAllinOneTMQ—PCR Mix在室温下融解．轻柔得上下颠倒混匀并进行短暂离心。同时在使用过程中始终保持避光。
2) PCR reaction mix的制备 (在冰上操作)
试剂 用量 终浓度
2XAllinOneTMQ—PCR Mix 10μl 1×
ddH2O 1μl
PCR Forward Primer（4μM） 2μl 0.4μM
PCR Reverse Primer（4μM） 2μl 0.4μM
cDNA 5μl
总体积 20μl
注意：在实验中也设计了NTC(No Template Control)，其为阴性对照，即在反应中用水来代替模板cDNA，其它试剂不变．从而来质控是否体系有污染。迅速将PCR reaction mix稍混匀，并加入8联管中。
3) 将8联管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。
4) PCR 反应，采用了标准的三步法程序进行反应：
循环数 步骤 温度 时间 检测
1 预变性 95℃ 10min Off
40 变性 95℃ 10sec Off
退火 57℃ 20sec Off
延伸 72℃ 15sec On
5) 在PCR 反应后．采用以下的程序进行熔解曲线分析
温度 温度间隔 时间 检测
72℃~95℃ 0.5℃ 6sec/each On
30℃ 30sec off
5. 定量PCR数据分析
实验外包-Real-Time PCR实验流程
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