实验外包-TUNEL细胞凋亡检测试剂盒操作流程
TUNEL细胞凋亡检测试剂盒操作流程
1.操作流程概览
2.细胞样本制备
准备：
● PBS：8.0g NaCl， 0.2 g KCl， 1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4，溶于800ml去离子水中，HCl调pH至7.4，加水定容至1L。
● 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鲜配制；
● 封闭液：3%H2O2溶于甲醇；
● 细胞膜通透液：0.1%TritonX-100溶于PBS，新鲜配制；
操作步骤：
1)经过实验处理的细胞爬片或细胞涂片，自然晾干；
2)室温固定15min~30min；PBS漂洗3×5min；
3)浸入封闭液中，室温封闭10min；PBS漂洗3×5min；
4)浸入细胞膜通透液中，室温30sec~2min；
5)进行标记反应。
3.石蜡包埋组织切片预处理
准备：
● 石蜡切片脱蜡至水：二甲苯脱蜡2×10min，梯度乙醇水合（100%、95%、90%、80%、70%）；
● 蛋白酶K工作液：2 μL500×蛋白酶K + 998 μL PBS；
● 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鲜配制；
● 封闭液：3%H2O2溶于甲醇。
操作步骤：
1)石蜡包埋的组织切片按常规方法脱蜡至水；
2)PBS漂洗3×5min；
3)加入蛋白酶K工作液，37℃反应15~30min；PBS漂洗3×5min；
4)（选择进行）室温固定15min~30min；PBS漂洗3×5min；
5)浸入封闭液中，室温封闭10min，PBS漂洗3×5min；
6)进行标记反应。
4.冰冻组织切片预处理
准备：
● 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鲜配制；
● 封闭液：3%H2O2溶于甲醇；
● 细胞膜通透液：0.1%TritonX-100溶于PBS，新鲜配制；
操作步骤：
1)冰冻切片浸入固定液，室温固定10min；PBS漂洗3×5min；
2)浸入封闭液中，室温封闭10min；PBS漂洗3×5min；
3)浸入通透液中，室温30sec~2min；
4)进行标记反应。
5.阳性对照和阴性对照的准备
TUNEL检测时需要设立阳性对照和阴性对照，以显示实验的客观性和准确性。
1)阳性对照样本的处理（选择进行）
DNaseI反应液（用户自备）： （10U-3000U DNase I；40mM Tris-HCl pH 7.9；
10 mM NaCl；6mM MgCl2；10mM CaCl2）
组织样本经过蛋白酶K处理或者通透液处理，PBS浸洗后，加入100 μL DNaseI反应液，室温孵育10~30min，用去离子水彻底清洗玻片，浸入PBS漂洗5min，进行标记反应。
2)阴性对照样本的处理
在进行标记反应过程配制TdT酶反应液时，不加入TdT酶，其余步骤相同。
四、标记和显色反应
以下操作在湿盒内进行。
1.预处理好的样本经过PBS漂洗后，用滤纸轻轻吸去样本周围液体；
2.每个样本滴加100 μL TdT酶反应液，于37＆#61616;C避光反应60min；
TdT酶反应液的准备（即用即配）：
成分 标准100 μL/片 切片数 总体积
Equilibration Buffer 98 μL × =
Biotinylated Nucleotide Mix 1 μL × =
TdT Enzyme 1 μL × =
阴性对照片不加TdT酶。
3.用去离子水按1：10稀释20×SSC，进行终止反应，室温15min；然后PBS漂洗3×5min；
4.浸入0.3%H2O2/PBS中封闭内源性过氧化物酶活性，室温孵育3~5min；PBS漂洗3×5min；
5.滴加100 μL Streptavidin-HRP工作液（按1：500稀释为工作液），于37℃反应30~60min；
6.PBS漂洗3×5min；
7.滴加DAB显色液：
成分 100 μL/片 切片数 总体积
20×DAB Substrate Buffer 5 × =
20×DAB Chromogen 5 × =
20×Hydrogen Peroxide 5 × =
ddH2O 85 × =
8.用去离子水漂洗数次；（选���进行复染细胞核）；
9.中性树胶封片，显微镜下观察。
注意事项：
1.PBS清洗后，请尽量去除PBS液体再进行下一步反应；
2.避免载波片上的样本干燥造成实验失败；
3.TdT酶反应液应即用即配，在冰上进行，不宜长期保存；
4.复染细胞核可以用甲基绿染液（用户自备）。
实验外包-TUNEL细胞凋亡检测试剂盒操作流程
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