实验外包- TUNEL细胞凋亡检测实验方法
TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒是采用非同位素方法来检测细胞在凋亡过程中DNA 的断裂情况，可在原位快速准确地检测单个凋亡细胞。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。
TUNEL细胞凋亡检测实验方法
对于贴壁细胞或细胞涂片
a. PBS或HBSS洗涤一次。
b. 如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。
c. 用4%多聚甲醛或碧云天生产的**染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。
d. 用PBS或HBSS洗涤一次。
e. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分钟。
f. 转步骤5。
对于悬浮细胞或细胞悬液
a. 收集细胞(不超过200万细胞)，PBS或HBSS洗涤一次。
b. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水
平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。
c. 用PBS或HBSS洗涤一次。
d. 用含0.1% Triton X-100的PBS重悬细胞，冰浴孵育2分钟。
e. 转步骤5。
对于石蜡切片
a. 二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。
b.滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30分钟(不同组织的*佳作用温度和时间需自行摸索)。
c. PBS或HBSS洗涤3次。注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。
d. 转步骤5。
对于冷冻切片
a. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。
b. PBS或HBSS洗涤2次，每次10分钟。
c. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分钟。
d. 转步骤5。
配制TUNEL检测液
参考下表配制适当量的TUNEL检测液，需充分混匀。注意：配制好的TUNEL检测液必须一次使用完毕，不能冻存。
1个样品 5个样品 10个样品
TdT酶 2μl 10μl 20μl
荧光标记液 48μl 240μl 480μl
TUNEL检测液 50μl 250μl 500μl
对于贴壁细胞、细胞涂片或组织切片
a. 用PBS或HBSS洗涤2次。
b. 在样品上加50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。注意：孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少TUNEL检测液的蒸发。
c. PBS或HBSS洗涤3次。
d. 用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。
对于悬浮细胞或细胞悬液
a. 用PBS或HBSS洗涤2次。
b. 加入50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。
c. PBS或HBSS洗涤2次。
d. 用250-500μl PBS或HBSS悬浮。
e. 此时可以用流式细胞仪进行检测或涂片后在荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范
围为515-565nm(绿色荧光)。
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