目前已经公布了一些项目,这些项目也倍受读者的关注。为了感谢这些分享实验技巧的参选者,于2010年8月10日进行**轮**,从在此之前投稿的参选者中抽出三名,送出上海世博会门票一张。生物通将生物通
华东师范大学的张满仓对TUNEL方法进行了一些改进。
参选项目:TUNEL方法的改进
背景:细胞凋亡检测是生物学研究中十分重要的技术,TUNEL就是凋亡检测的可靠方法,它不仅能够定量而且还可以定位研究,尤其适合Wholemount的整体检测,比如斑马鱼、小鼠、鸡的胚胎等。虽然它操作简单、灵敏特异、结果准确可靠。但是价格较贵,尤其是进口的,比如罗氏的50次TUNELKit价格五千元左右,另外比起切片和细胞的TUNEL,wholemount的实验中TdT酶混合物有时很难进入组织内部反应。
方法改进:1,对于Wholemount的TUNEL,我们在原Protocol的基础上改动孵育温度和时间,也就是加入酶反应液37度60min孵育改为4度过夜后再在37度孵育30min,这就很好的解决了难以进入部分组织反应的问题,而且可以有效降低背景
2,将标准Protocol的每次50ul反应体系缩减,对于wholemount的胚胎,以完全浸没即可,比如15条斑马鱼胚胎则只需加20ul反应液,将管口用parafilm封闭好即可反应。而对于细胞样品,甲醛固定后,直接在coverslip上滴加10-20ul的反应液,倒扣于干净的载玻片上,湿盒中37度反应60min即可。
结果:Wholemount的结果很理想,如图所示,斑马鱼平台的头部出现特异的凋亡。缩小反应体系和标准反应体系比较无显著差别。