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**组化操作步骤

SABC（Strept Actividin-Biotin
Complex）法是一种显示组织和细胞中抗原分布的简便而敏感的**组化染色方法。由于该方法中的链霉亲和素的等电点接近中性
（pH=6.0-6.5），对组织和细胞的吸附性特别低，因而具有较低的背景。它的步骤与其他**组化染色基本相似，有良好的可操作性。
1)、载玻片防脱片剂处理：应用多聚赖氨酸涂片时，应使用塑料容器稀释多聚赖氨酸，防止多聚赖氨酸过多吸附于容器上，在染色时出现脱片现象。
2)、切片常规脱蜡至水：二甲苯虽然可以反复使用，但次数不宜多。乙醇的浓度是从高到低，与脱水时相反。
3)、灭活内源性酶：博士德推荐应用3%的双氧水，但实际操作中，使用30%双氧水和纯甲醇按1:9的溶剂比混合较为理想。
4)、抗原修复：在灭活内源性酶后，将玻片放入0.01％的柠檬酸盐缓冲液中，用微波炉火电热炉加热至沸腾，关火，5－10分钟后，再加热至沸腾一次。由于β1-integrin在细胞膜上表达，因此没有必要进行热修复抗原或者微波修复抗原，只用到了抗原修复液。
5)、正常山羊血清封闭：封闭时应该注意室温与时间的相对关系。室温低，时间就要长一些，反之亦然。另外，保持反应池湿润是重要的一环，否则，前功尽弃。后面的步骤也是如此。
6)、一抗反应：一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度与背景有直接关系。一般说来，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时则相反。
一抗的浓度：这需要自行探索，虽然试剂公司给出了参考浓度，但仍然要探索出恰当的浓度，任何取巧的念头都是在自讨苦吃。
孵育时间与温度：抗原抗体充分反应是得到可靠结果的关键。因此，控制温度与时间也是一个严肃的问题。由于室温控制较为困难，建议4℃冰箱过夜（≥18h）。
7)、
二抗（生物素化山羊抗兔IgG）反应：观察发现，37℃条件下二抗反应20分钟，尽管反应池保持湿润，但在排除了其他因素后，仍然得不到阳性结果。原因在
于，二抗没有与其他溶液混匀而聚集在反应池四周，**组化在37℃孵育20分钟甚至更长的时间后，二抗干燥，根本没有充分反应。解决的方法是：二抗的量要相对多
些，同时要混匀；随时观察反应池的情况。
另外一种原因，就是仪器显示温度37℃，但实际只有23℃，自然结果难以令人满意。因此，查找原因时，不应被表面现象迷惑，应该认真地落实每一步，才能找到解决办法。
8)、SABC染色（37℃）：直接就可以用。
9)、DAB显色镜下控时：DAB浓度应该比推荐的要低一些，这样可以便于控制反应时间以及在合适的时候中止反应。同时注意，使用后残余的DAB应妥善处理，而不是随便倒入下水道，因为它可能有致癌性。
10)、苏木素轻度复染：不建议使用。尽管复染后标本层次分明，但实际情况是，这样有时也会掩盖阳性结果，从而使前功尽弃。
11)、脱水透明：脱水乙醇的浓度由低到高，有一个较准确判断脱水成功与否的办法是：观察透明后盛二甲苯容器的壁，若发现白色雾状现象，则说明脱水不成功，应再次脱水。透明时间不要太长，1分钟左右就可以了。
12)、封片：封片时，中性树脂量宜少，同时注意不要产生气泡。

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