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总RNA提取|实验技术服务

关键词:总RNA提取|实验技术服务
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总RNA提取|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
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测序实验流程：
（一）细胞总RNA的提取
1、6孔板细胞汇合度为90-100%时，取出无菌室，去其上清，用PBS洗两次后，每孔加TRIZOL试剂 1 ml，摇匀，无菌罩内消化3-5 min。
2、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5 ml EP管中，加新开的氯仿0.2 ml，轻摇15 s。
3、室温静置2-3 min后，12000 rpm，15 min，4 ℃，离心。然后取上清无色水相（约0.6 ml）到 EP管（DEPC处理过），加0.5 ml新开的异丙醇，室温下静置10 min。
4、12000 rpm，10 min，4 ℃，离心。观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清，75%乙醇1.0 ml洗涤（用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 min，4 ℃离心。
5、去上清，点离，用小Tip吸干液体。气干沉淀5-10 min， DEPC处理水20-30 μl加入，中枪打匀，55-60 ℃水浴10 min溶解总RNA，测OD值。
6、电泳。
（二）从总RNA中分离mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN）
1、取上述提取的总RNA若干（少于0.25 mg）到一个新的无RNase 的EP管中，用无RNase的水定容到250 μl。
2、加入Buffer OBB 250 μl, Oligotex Suspension 15 μl。用Tip打匀或用手弹匀。
3、70℃水浴，3 min（裂解RNA的二级结构）。
4、20-30℃条件下，静置10 min（让Oligotex与mRNA结合）。
5、高速离心2 min，小心吸走上清（该上清要保留），留下约50 μl的上清在原管里。
6、用Buffer OW2 400 μl重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀，然后将这些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上，高速离心1 min。
7、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加Buffer OW2 400 μl到柱子，高速离心1 min，丢掉滤过液。
8、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加20-100 μl热的（70 ℃）Buffer OEB到柱子上，用Tip来回吸打3-4 次，高速离心1 min。
9、为保证*大的 mRNA产量，可再次重复第8步。
10、电泳。

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