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总RNA提取服务|实验技术服务

关键词:总RNA提取服务|实验技术服务
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总RNA提取服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
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测序实验流程：
（一）细胞总RNA的提取
1、6孔板细胞汇合度为90-100%时，取出无菌室，去其上清，用PBS洗两次后，每孔加TRIZOL试剂 1 ml，摇匀，无菌罩内消化3-5 min。
2、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5 ml EP管中，加新开的氯仿0.2 ml，轻摇15 s。
3、室温静置2-3 min后，12000 rpm，15 min，4 ℃，离心。然后取上清无色水相（约0.6 ml）到 EP管（DEPC处理过），加0.5 ml新开的异丙醇，室温下静置10 min。
4、12000 rpm，10 min，4 ℃，离心。观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清，75%乙醇1.0 ml洗涤（用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 min，4 ℃离心。
5、去上清，点离，用小Tip吸干液体。气干沉淀5-10 min， DEPC处理水20-30 μl加入，中枪打匀，55-60 ℃水浴10 min溶解总RNA，测OD值。
6、电泳。
（二）从总RNA中分离mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN）
1、取上述提取的总RNA若干（少于0.25 mg）到一个新的无RNase 的EP管中，用无RNase的水定容到250 μl。
2、加入Buffer OBB 250 μl, Oligotex Suspension 15 μl。用Tip打匀或用手弹匀。
3、70℃水浴，3 min（裂解RNA的二级结构）。
4、20-30℃条件下，静置10 min（让Oligotex与mRNA结合）。
5、高速离心2 min，小心吸走上清（该上清要保留），留下约50 μl的上清在原管里。
6、用Buffer OW2 400 μl重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀，然后将这些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上，高速离心1 min。
7、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加Buffer OW2 400 μl到柱子，高速离心1 min，丢掉滤过液。
8、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加20-100 μl热的（70 ℃）Buffer OEB到柱子上，用Tip来回吸打3-4 次，高速离心1 min。
10、电泳。
9、为保证*大的 mRNA产量，可再次重复第8步。
1. 六孔板每孔细胞中加入1ml Trizol，冰上放置5min，枪头吹打。
2. 将各孔裂解液吸到1.5 ml EP管中，加入氯仿0.2ml/管，用力振摇15s。15－30℃下孵育2-3min，离心（4℃，12,000g，15min）。
3. 离心后液体分为三层（上层－无色水样层为RNA，中层白色为DNA和底层红色为蛋白质），小心吸取上层无色液体移入一新的EP管中。
4. 加入等体积异丙醇，0.4－0.5ml，混匀，15-30℃下孵育10－30min，离心（4℃，12，000g，10min）。其中如果加入等体积异丙醇后，置于试管架上用PE手套密封后，放于4℃冰箱中，沉淀30min效果更好。
5. 去上清，沉淀加入75％乙醇1ml，漩涡振荡30s，离心（4℃，7,500g，5min）。
6. 小心去上清，管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min。*好是用枪头吸取上清，尽量除去。
7. 加入20ul DEPC水溶解，分装5ul/管，-70℃冰箱保存。
8. 细胞总RNA的鉴定：0.9-1.2％琼脂糖电泳鉴定细胞总RNA，观察出现条带及各条带亮度。紫外分光光度计测定：分别测定细胞总RNA在260nm和280nm处的光密度值(OD)，并计算RNA的含量和纯度。

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