从土壤等复杂样品中提取DNA

发布时间：2015-11-04

在植物赖以生存的土壤中，生活着大量的微生物，包括**、**、放线菌、病毒和原生生物等。据估计，1 g土壤中有4,000～7,000种**，数量近10亿个。然而，由于土壤环境的复杂性，常规的培养法、生物量测量法都对这些微生物束手无策。这时，分子生物学技术就成为研究土壤宏基因组的新式武器。
尽管我们派出了新式武器，但土壤毕竟不同于实验室的**培养液，土壤本身的异质性、微生物的多样性及其对土壤颗粒的黏附都使得DNA的提取比较困难。此外，样品中常常存在腐植酸类物质，它们可能抑制下游反应中的DNA聚合酶和限制性内切酶的活性，降低转化效率，须尽量除去。因此，一般的dna提取试剂盒是无法胜任的，专门的土壤DNA提取试剂盒才更给力。
美国MO BIO公司专门研究复杂样本的核酸纯化，针对土壤样品、水样及生物膜，推出了一系列DNA提取试剂盒。有了这些试剂盒，一切就简单多了。不用费心地去研究各个版本的protocol，不用担心抽提效果不好，连配试剂也省了。
土壤样品的DNA提取
MO BIO有两个系列的土壤dna提取试剂盒，Ultra和Power。Ultra可谓入门级，它能够从土壤中提取PCR级的DNA，并去除样品中的腐植酸。目前，UltraClean® 土壤DNA提取试剂盒已逐渐成为世界各地土壤微生物研究者们的优选方法。Power则是强力级，包含**的抑制剂去除技术，在应对抑制剂方面当然更为强大，是处理复杂样品的更好选择。
纯化的原理并不复杂。首先将土壤样品加入管中，此管还含有微珠、裂解液、微珠溶液和抑制剂去除溶液。通过热、去污剂以及机械力这三大组合，来裂解微生物。随后，通过震荡器的机械作用裂解细胞。裂解后，释放出的DNA结合到硅胶膜上。洗涤之后回收DNA。整个过程非常快速，在30分钟内即可完成。
若样品是基本土壤，那可以选择Ultra系列。它能够有效去除抑制剂，快速纯化出高质量的DNA，长度达 50 kb以上。密歇根州立大学植物学和植物病理学系的Elise C. Poole在使用了这款试剂盒后，评价相当高。“我的研究涉及到广泛的土壤取样，分析土壤中马铃薯疮痂病菌的存在。我已经使用此试剂盒来处理样品，并对结果非常满意，不仅DNA的量稳定，且质量很高，适合PCR。我会继续使用，因为它很快，我用过的其他试剂盒都没有这么快。”
但若是面对更有挑战性的样品，如高腐植酸含量样品，包括堆肥、沉积质和化肥等，那Power系列才是理想之选。这个新一代的产品有着**的抑制剂去除技术(IRT)，能够从即使是困难的土壤类型中去除腐植酸和土壤中的褐色物质，为下游成功的PCR分析助上一臂之力。后续的PCR分析适合多种生物的检测，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、**、藻类，放线菌类以及线虫类等。
据MO BIO介绍，美国国家环境保护局、农业部、FBI和疾控中心均使用了这些土壤DNA试剂盒，用于生物防治、农业和生态分析。其实，PowerSoil® 土壤DNA提取试剂盒还能用于土壤之外的其他样品类型。MO BIO的客户就曾成功提取了食品(奶酪、牛奶、肉类、水果)、水、昆虫和粪便样品中的DNA。所以说，名字都是浮云，实践才是王道。
Ultra和Power系列各有三种DNA提取试剂盒，分别适用于不同的样品量和通量。除了基本型之外，还有96孔形式的高通量试剂盒和适合大量样品的试剂盒。
土壤DNA提取试剂盒的选择指南：

名称	通量	样品量	结合能力	处理时间
PowerSoil®土壤DNA提取试剂盒	1-24	250 mg	20 µg per filter	30分钟
PowerSoil®-htp 96孔DNA提取试剂盒	96-384	250 mg	20 µg per well	不到1天（384个样品）
PowerMax®土壤DNA大量提取试剂盒	1-24	10 g	1 mg per filter	30分钟
UltraClean®土壤DNA提取试剂盒	1-24	1 g	20 µg per filter	30分钟
UltraClean®-htp 96孔土壤DNA提取试剂盒	96-384	250 mg	20 µg per well	不到1天（384个样品）
UltraClean®大量土壤DNA提取试剂盒	1-8	20 g	1 mg per filter	50 分钟

水样的DNA提取
MO BIO为水样中的DNA提取提供了三种试剂盒：Ultra、Rapid和Power。Ultra和Power的区别同样是入门级和强力级之差，而Rapid则顾名思义，快，它能够在15分钟之内快速提取不浑浊水样中的DNA。
首先，通过试剂盒提供的0.22 µm或0.45 µm滤膜过滤水样。当然，如果你自己有滤膜的话，也可以购买不带滤膜的试剂盒。这种醋酸纤维素膜是安装在一个过滤杯中的，可轻松取出，立即使用或留待后用。过滤捕获到微生物后，将滤膜放入管中，此管中还含有微珠、微珠溶液和裂解液。通过化学和机械作用力裂解微生物，并通过震荡器的机械作用裂解细胞。之后，释放出的DNA与硅胶膜结合，洗涤后回收。
若是不浑浊的水样，可选择RapidWater™ 快速水样DNA提取试剂盒，改进过的裂解和结合技术提高了低生物量样品的DNA产量。若是浑浊且复杂的水样，可选择PowerWater® DNA提取试剂盒。它是新一代的从各种水样中提取DNA的试剂盒，采用了IRT**技术，即使水样中含有大量的污染物，也能够成功提取出高产量和高质量的 DNA。若居于两者之间，那么UltraClean® 水样DNA提取试剂盒更适合。它可在35分钟内提取水中微生物的DNA，得到的高质量DNA(50kb以上)可应用于PCR、限制性酶切消化以及其它应用。
水样DNA提取试剂盒的选择指南：

名称	通量	样品量	结合能力	处理时间
PowerWater® DNA提取试剂盒	1-4	100ml-数L	20 µg per filter	20分钟
RapidWater™ 快速水样DNA提取试剂盒	1-4	100ml-数L	20 µg per filter	14分钟
UltraClean® 水样DNA提取试剂盒	1-10	100ml-数L	1 mg per filter	35分钟

生物膜的DNA提取
许多微生物粘��在胞外多聚物(EPS)上，形成了生物膜。在EPS基质上，还发现了很多化合物，包括腐植酸、金属、盐和农药。因此，生物膜上的微生物很难裂解，而核酸，即使提取出来，仍含有大量抑制剂。过去也有一些从生物膜中提取核酸的方法，但通常需要数小时甚至数天才能完成。
为此，MO BIO推出了PowerBiofilm™ 生物膜DNA提取试剂盒。它将生物膜预处理，并改善了细胞裂解，再加上**的抑制剂去除技术，带来了高质量且无抑制剂的DNA。对于生物膜的核酸纯化而言，困难的一步恐怕要算微生物的彻底裂解。若想高效裂解，必须降解EPS。怎么降解呢?方法不外乎几种：化学法、机械法和酶法。 PowerBiofilm试剂盒利用这几种方法的组合来降解EPS，让微生物彻底暴露在裂解液中。之后使用微珠、标准裂解液和裂解增强液，确保微生物群落的佳裂解。
不过，裂解是裂解了，还不能高兴地太早，降解的EPS及其他化合物仍会残留，抑制核酸的下游应用。为了防止这一点，PowerBiofilm试剂盒使用**的IRT技术去除腐植物质、多糖和多酚。通过这几步组合拳，生物膜中的DNA总算是顺利提取出来，且抛开了恼人的抑制剂。

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