IHC/ICC 常见问题分析

1. 无染色

①脱蜡不：延长脱蜡时间，更换二甲苯。

②固定步骤（使用福尔马林和多聚甲醛固定剂）修饰了抗体识别表位：抗原修复法暴露出抗原表位，缩短固定时间。

③蛋白位于细胞核内（核蛋白），抗体不能穿透核膜：在封闭液和抗体稀释液中加入通透剂。

④PBS缓冲液被**污染后破坏了靶蛋白的磷酸根：在抗体PBS储存液中加入0.01%叠氮化合物，或使用新鲜无菌的PBS。

⑤由于不当储存、稀释或反复冻融造成一抗/二抗试剂盒失效：做阳性对照确认一抗/二抗试剂盒的有效性。

2. 高背景

①没有封闭非特异性结合或封闭不充分：延长封闭时间，并考虑改换封闭剂。

②一抗浓度过高：滴定法寻找到适宜抗体浓度，或在浓度较低抗体中延长孵育时间（建议是缓慢而准确地结合）。

③存在内源性过氧化物酶活性：用酶抑制剂如抑制碱性磷酸酶的盐酸**咪唑(2mM)，或抑制过氧化物酶的H2O2(0.3% v/v)。

④固定过度（固定剂用福尔马林和多聚甲醛）导致抗体识别抗原位点被修饰：改变抗原修复方法，缩短与抗原修复液的孵育时间。

⑤通透作用破坏膜并除去了膜蛋白：去除缓冲液中的通透剂。

⑥组织冲洗不，有固定剂残留：所有步骤都要用PBS充分洗涤。

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