1.怎么判断抗体满足ChIP要求?
通常每个公司的抗体说明都标有级别(grade),ChIP级。如果没有,通常的规则是ChIP-PCR分析阳性control是阴性control的5倍以上的抗体认为是到达了ChIP级。
2.如果没有商业化的kit怎么办?
表达的表位标记的蛋白也可以。经常使用的标签包括HA,Flag,Myc和V5。除了表位的抗体,所述靶蛋白也可以标记有生物素受体序列,其可以与生物素经由生物素连接酶在体内或体外进行标记。
3.多少细胞数合适?
10^6到10^7个细胞才能终得到10到100ng ChIPed DNA。一般10^6可以满足高丰度蛋白(如RNA polymerase II)和局部组蛋白修饰(如H3K4me3)的ChIP。如果是低丰度的转录因子蛋白和其他组蛋白修饰则需要10^7个细胞。
4.用什么作为Control?
关于control是问得多,也是困惑的一个问题。
不推荐IgG,原因是:,大多数的IgG抗体不是来源于转录因子或特定组蛋白抗体同一动物的免疫前血清。**,IgG通常pull down非常少的DNA,这样导致在后期的建库过程中PCR Cycles 数增加,导致不能达到作为control去除背景噪音的目的(会缺失和放大部分信息)。
因此比较而言,Input更适合作为control。Input的建库量够,这样建库过程不需要over-amplifed,bias小。其次,后测序得到的数据更均匀,以及全基因组覆盖度会更好。有人提到deletion 或者 RNAi knockdown目标转录因子的细胞同时做ChIP-Seq作为control更好。
5.是否需要生物重复?
有人建议需要生物重复,但是从我经历的项目来看,生物重复性不太好。还有人推荐用不同公司的抗体来做生物重复,这就需要考虑到经费的问题。
6.关于超声处理
超声没有什么特别的,需要注意的是超声处理在含有SDS的缓冲液中可能会破坏蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用。但是含有SDS的缓冲液能增加超声的效率,适应与DNA紧密结合的转录因子的ChIP-Seq。近遇到一个老师,他的项目是一个转录因子跟不同的Parters蛋白结合,再binding到相关的区域,行使调控功能。这种情况就不建议用含有SDS的缓冲液了。
7.交给Vendor后是否万事大吉?
这里还提些数据分析过程中需要注意的问题。需要多少数据量?大部分人认为20 Mb 是个比较适合选择。
Call peak不同软件各有优势。
Peak 类型
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适合项目
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工具
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大(Broad)
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组蛋白
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CCAT,SICER
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小(Sharp)
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转录因子
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MACS
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大和小(Sharp&Broad)
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ZINBA
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需要注意的是重复区域的peaks可能被忽视,原因是在前期的数据处理过程中,mapped到不同位置的reads被丢掉,而这些reads大部分是因为比对到重复区域。
另外一个问题是怎么比较不同细胞和不同条件下ChIP后测序得到的数据。ChIP条件的不同,背景噪音也不同,加上测序系统误差,所以需要均一(normalization)的软件在样本比较前对数据进行预处理。近有个工具DIME可以处理这个问题。