细胞的复苏
复苏细胞与冻存的要求相反,应采用快速融化的手段。这样可以细胞外结晶在很短的时间内即融化,避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。
用品:
培养液,吸管,离心管,培养瓶,带盖搪瓷罐。
步骤:
(1)、从保存安瓿的小袋内或支架上取出的安瓿应直接投入 37℃ 温水中,并不时摇动令其尽快融化。如果安瓿熔封不严,在保存过程中液氮进入安瓿中,从液氮罐中取出时由于温度升高导致液氮急速气化而爆炸,使安瓿变得粉碎,飞溅的玻璃碎片可伤害面部等。因此,存取安瓿时都要佩戴眼镜和手套,安瓿投入存放温水的器皿中后应立即把盖子扣上,以防发生意外。
(2)、从 37℃水浴中取出安瓿,用酒精消毒后折断颈部,用吸管吸出细胞悬液,注入离心管并滴加10倍以上培养液,混合后低速离心,除去上清液,再重复用培养液洗一次。
(3)、用培养液适当稀释后,接种培养瓶,放在37℃温箱静置培养,次日更换一次培养液,继续培养。如果复苏时细胞密度较高要及时传代。
细胞复苏时细胞数可以做10-20倍稀释,接种密度以 5*105/ml为宜。
注意事项:
1、取细胞的过程中注意带好防冻手套,护目镜。此项尤为重要,细胞冻存管可能漏入液氮,解冻时冻存管中的气温急剧上升,可导致爆炸。
2、冻存液的问题:冻存液的配置已是常识,在这里不做详述,但是二甲基亚砜(DMSO)对细胞不是无毒副作用,在常温下,二甲基亚砜对细胞的毒副作用较大,因此,在1-2min内是冻存液融化。 如果复苏温度较慢,会造成细胞的损伤,二甲基亚砜(DMSO)好选择进口产品。
3、离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高,注意加入少量培养液可稀释其浓度,以减少对细胞的损伤。
4、离心问题:主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养,**天换液。因为离心的目的是两个,去除DMSO,去除死细胞,这个是标准流程,但对一般来说,把握不好离心转速时间,转的不过活细胞沉底的少,细胞就全被扔掉了,转过了活细胞会受压较大,死亡。此外在操作过程中容易污染,所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜(DMSO),DMSO对细胞有的毒副作用,所以须将离心后的液体前倒净,且倒干净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏,结果无有异常。
5、细胞贴壁少的问题:教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml-15m培养液,而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附
6、复苏细胞分装的问题:实验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中,分装过多,细胞浓度过低,不利于细胞的贴壁。
7、加培养基的量放入问题:这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度,从如果你加培养基的太少,那么DMSO的浓度就会比较大,就会影响细胞生长,从以前的资料来看,DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响,还有一个说法是1%。所以如果你的冻存液的浓度是10%DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。