1、石蜡切片简介
石蜡切片（paraffin section） 组织学常规制片技术中*为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。教学中，光镜下观察切片标本多数是石蜡切片法制备的。活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。
2、基本技术
-
简单说明
石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与贴片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为长久性显微玻片标本。
-
取材
应根据要求选取材料来源及部位。例如植物细胞有丝分裂多选取洋葱根尖，细胞分裂快又便于切取；猪的肝小叶边界清晰明确；耳蜗以豚鼠的内耳易于定位和剥离。材料必须新鲜，搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及**的滋生，而不能反映组织活体时的形态结构。
-
固定
用适当的化学药液——固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分���终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。固定能使组织硬化，有利于切片的进行，而且也有媒浸作用，有利于组织着色。固定液的种类很多，其对组织的硬化收缩程度以及组织内蛋白质、脂肪、糖类等物质的作用各不相同。例如纯酒精可固定肝糖而能溶解脂肪，甲醛能固定一般组织，但溶解肝糖和色素。固定液可分为单一固定液及混合固定液。前者有甲醛（乙醛、福尔马林）、酒精、醋酸或冰醋酸、升汞、锇酸（四氧化锇）、重铬酸钾及苦味酸等，单一固定液不能固定细胞中的所有成分；混合固定液可以互补不足，常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa液（配方见有关技术书籍）。因此，应根据所要显示的内容来选择适宜的固定液。10%福尔马林（4%甲醛）或10%磷酸缓冲福尔马林是病理切片常规使用的固定液，不仅适用于常规苏木精-伊红（HE）染色，还可以用于组织学有关的其他技术的切片染色。固定液的用量通常为材料块的20倍左右，固定时间则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以从1小时至数天，通常为1小时至24小时。
-
洗涤与脱水
固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果。该步骤称作洗涤多数用流水冲洗；使用含有苦味酸的固定液固定的则需用酒精多次浸洗；使用酒精或酒精混合液固定的组织，则不必洗涤，可直接进行脱水。固定后或洗涤后的组织内充满水分，若不除去水分则无法进行以后的透明、浸蜡与包埋处理，原因在于透明剂多数是苯类，苯类和石蜡均不能与水相溶合，水分不能脱尽，苯类无法浸入。酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混。为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30%或50%酒精开始，经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1～数小时，如不能及时进行各级脱水，材料可以放在70%酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化，不宜处理过久。正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陆环等也可做脱水剂。
-
透明
纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各种透明剂均是石蜡的溶剂。通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1～2小时，再转入纯透明剂中浸渍。透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及属于囊腔抑或实质器官而定。如果透明时间过短，则透明不彻底，石蜡难于浸入组织；透明时间过长，则组织硬化变脆，就不易切出完整切片，*长为数小时。
-
浸蜡与包埋
用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1～2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。通常石蜡采用熔点为56～58℃或60～62℃两种，可根据季节及操作环境温度来选用。
-
切片
包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为4～7微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。
-
贴片与烤片
用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后的脱蜡、水化及染色等步骤中二者滑脱开。粘附剂是蛋白甘油。首先在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，再将一定长度蜡带（连续切片）或用刀片断开成单个蜡片于温水（45℃左右）中展平后，捞至玻片上铺正，或直接滴两滴蒸馏水于载玻片上，再把蜡片放于水滴上，略加温使蜡片铺展，*后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入45℃温箱中干燥，也可在37℃温箱中干燥，但需适当延长时间。
-
切片脱蜡及水化
干燥后的切片需脱蜡及水化才能在水溶性染液中进行染色。用二甲苯脱蜡，再逐级经纯酒精及梯度酒精直至蒸馏水。如果染料配制于酒精中，则将切片移至与酒精近似浓度时，即可染色。
-
染色
染色的目的是使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色以便于观察。未经染色的细胞组织其折光率相似，不易辨认。经染色可显示细胞内不同的细胞器及内含物以及不同类型的细胞组织。染色剂种类繁多，应根据观察要求及研究内容采用不同的染色剂及染色方法，还要注意选用适宜的固定剂才能取得满意的结果。经典的苏木精（Hematoxylin）和伊红（曙红，Eosin）染色法是组织学标本及病理切片标本的常规染色，简称HE染色。经HE染色后，细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。由于苏木精是带阳离子的染料，染液呈碱性，核内染色质及胞质内核糖体等物质对这种染料有亲和性，称嗜碱性；而带阴离子的染料伊红配制的染液呈酸性，对这种染料的亲和性，称嗜酸性。有时不同的组织结构还需要用特殊的染料及染色方法加以显示，称特殊染色。有些细胞组织经硝酸银浸润后，可使溶液中银离子还原成金属银或银粒附着在细胞组织上，呈棕黑色，这种性质称亲银性，而有些细胞组织本身不能使硝酸银的银离子还原成金属银，还需加还原剂才能将银离子还原，称嗜银性。
-
切片脱水、透明和封片
染色后的切片尚不能在显微镜下观察，需经梯度酒精脱水，在95%及纯酒精中的时间可适当加长以保证脱水彻底；如染液为酒精配制，则应缩短在酒精中的时间，以免脱色。二甲苯透明后，迅速擦去材料周围多余液体，滴加适量（1～2滴）中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡，封片后即制成长久性玻片标本，在光镜下可长期反复观察。注意有些染料需特定厂家生产的产品。根据各种染色方法、组织类别及切片厚度，掌握适宜的染色时间，才能达到较好的染色效果。
3、技术结合
石蜡包埋组织流式细胞仪DNA含量分析 是石蜡包埋组织切片与流式细胞术（flow cytometry，FCM）结合使用来测量DNA含量及倍体分析，这一结合是流式细胞仪在临床应用中，特别是在肿瘤研究方面开拓了新的研究途径。FCM是激光、电子和电子计算机、流体喷射技术的综合发展应用，是快速定量分析细胞的技术，要求被检细胞呈悬浮状态。已可测量细胞的大小、体积、DNA含量、DNA合成速率、RNA含量、表面抗原、染色体等。由于制备样品技术的原因，过去许多流式分析资料**于采用新鲜组织标本，Hedley等1983年首先报导了FCM分析石蜡包埋组织切片制备分散细胞悬液技术来进行DNA含量的检测，从组织切片中能获得足够数量的单个细胞，且与新鲜组织分离获得的单个细胞在形态及DNA含量组方图上均极为相似。国内也在逐步开展这方面的研究。由于这种方法取材可在病理组织观察或诊断基础上进行，比活检或手术切除标本更为准确，又可做回顾性研究分析；且对DNA检测速度快、数据客观可靠，在肿瘤诊断、预后的预测和**反应上具有重要价值；利用过去的标本可成批制作细胞悬液、成批上机测试，避免了仪器调试状态不同带来的影响，石蜡包埋块保存时间的长短对结果影响不大。
常规固定（多数用福尔马林）、石蜡包埋的组织块均可用于流式细胞术，但含苦味酸或汞的固定���均不宜使用。切片厚度以30～50微米为宜。切片脱蜡要干净、彻底，否则制备出的细胞悬液中碎片多，影响测定。梯度酒精水化后用胃蛋白酶或胰蛋白酶消化，消化后镜检呈单个分散状态；由于福尔马林固定可使DNA和核蛋白产生共价交联，影响DNA和染料的化学定量结合，导致荧光强度下降，蛋白酶可破坏其联结，改善测定的组方图质量，消化时间以能分散细胞及细胞碎片尽量少为适度，以100目尼龙筛网滤去未消化完的组织片，离心去上清液后，加入冰冷的70%酒精固定，放入4℃冰箱备用。上机前染色。DNA特异荧光染料主要有：（1）碘化丙锭（PI）；（2）溴化乙锭（EB）；（3） 4，6-二脒基-二苯基吲哚（DAPI）。FCM检测石蜡包埋组织细胞DNA含量可做为以形态学为基础，多参数综合诊断中的一个重要的新手段。由于仪器设备价格昂贵及制备样品的诸多环节均可能影响测定的数据，限制了临床的广泛使用。
4、参考文献
[1] 赵俊,木万福,张志星.植物石蜡切片技术改进[J].安徽农学通报, 2009(5):2.DOI:10.3969/j.issn.1007-7731.2009.05.032.
[2] 王东,史景泉.石蜡切片ARF免疫组化检测P53蛋白的初步报告[J].第三军医大学学报, 1994, 16(1):52-54.DOI:10.1007/BF02007173.
[3] 杨捷频.常规石蜡切片方法的改良[J].生物学杂志, 2006, 23(001):45-46.DOI:10.3969/j.issn.2095-1736.2006.01.015.
[4] 马恒辉,徐玮,孟奎,等.使用超声处理仪制备快速石蜡切片的体会[J].中华病理学杂志, 2001, 30(1):65-65.DOI:10.3760/j.issn:0529-5807.2001.01.020.
[5] 张舍郁,程安春,汪铭书,等.间接免疫荧光检测石蜡切片中鸭肿头出血症病毒及抗原定位方法的初步建立[C]//第四届第九次国内学术研讨会暨饲料和动物源食品**战略论坛论文集（下册）.2008.DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2008.03.033.
