改进的间接酶联**法检测磺胺类**

改进的间接酶联**法检测磺胺类**

实验原理

62.5mgTS，34.5mgN-羟基琥珀酰亚胺酯和45.3mg 1,3-二环己基碳二亚胺在1.5ml的干燥的N,N-二甲基酰胺中反应18h， 4^oC，通过滤过作用移除生成的二环乙基脲沉淀物，得到滤液。滤液被加到含有65mgLPH 2ml的PBS中，用NaOH调节PH到7.6。这个混合液在4^oC，搅拌24h。通过TLC检测磺胺药有没有聚合现象。因为低碱性自由的氨基磺酸簇（例如，磺胺噻唑pka是2.36），尤其赖氨酸的氨基簇(pka10.28)。可能是每一种氨基酸形成酰胺的主要原因。24h后，这个反应混合物被转移到透析液里，透析对抗1L 8M尿素12h，透析液被移到4L，50mM的碳酸氢氨中，接着移到4L，25mM的碳酸氢氨，每一种透析液至少8h。透析袋中的内容物被冻干。TS-bsa使用相同的方法，bsa代替LPH。

实验试剂

无水硫酸钠；150ml甲醇；100ml盐酸； 2.1g 2-氨基-4-噻唑乙酸；

2.65g N-Acetylsulfanilyl chloride (ASC)；50ml吡啶；100ml二氯甲烷层；

5g硅胶；50g二氧化硅柱(50*2.4)；200ml 1:4的甲醇-氯仿洗脱

50ml 2MNAOH溶液；100ml 6N的盐酸。

实验材料

50 ml的圆底烧瓶

250 ml三颈烧瓶

实验步骤

2-氨基-4-噻唑-乙酸甲酯的合成：

1. 在冰浴中，将无水硫酸钠干燥的甲醇100ml，加到一个250ml的三颈烧瓶。

2. 将盐酸气体加到装有甲醇的烧瓶中，不停搅拌，产生大量气泡。当溶液的质量增加大约60g，停止加盐酸。

3. 将2.1g的2-氨基-4-噻唑乙酸缓慢的加到烧瓶里，除去冰浴，搅拌10分钟。

4. 烧瓶中的溶液进行回流6小时，此时为轻微的黄色溶液。

5. 将溶液移入一个快速蒸发仪中，加入25ml干燥的甲醇，移除溶剂。

6. 从乙酸乙酯和甲醇中再结晶出来的固体为合成的固体(熔点为169-171^o C)，即2-氨基--噻唑乙酸甲酯，浅黄色。

N4-乙酰基-N1-{4-[(甲氧羟基)甲基]-2-噻唑}-磺胺的合成：

1. 将2.65gN-Acetylsulfanilyl chloride(ASC)加到一个50ml的圆底烧瓶中，在搅拌下，加入5ml干燥的吡啶。

2. 将1.50g的2-氨基-4-噻唑乙酸乙酯缓慢的加入到吡啶溶液中，维持温度在不超过40 ^oC。溶液为褐色的，进行回流，1.5h，冷却到室温。

3. 缓慢搅拌下，加入30ml温水，用二氯甲烷(3*25)萃取。

4. 二氯甲烷层用硫酸钠干燥，滤过，同时大部分溶剂用快速旋转蒸发仪移除。加入大约5g硅胶，移除剩余的溶剂，留下一些淡黄色的粉末。这些粉末经过一个50g的二氧化硅柱(50*2.4)，这个柱子用150ml 1:4的甲醇-氯仿洗脱，.移除这些溶剂，得到N4-乙酰基-N1-{4-[(甲氧羟基)甲基]-2-噻唑}-磺胺(1.6g，50%产量)。

N-[ 4- Carboxymethy1) -2-thiazolyl]sulfanilamide(TS)的合成：

25ml，2MNAOH溶液加到提纯的0.95g N4-乙酰基-N1-{4-[(甲氧羟基)甲基]-2-噻唑}-磺胺中，回流2h，冷却至室温后，用6N的盐酸调节PH到4.0。得到的浑浊的溶液用乙酸乙结合物测定抗原决定簇密度和自由芳香族氨基的存在。

1. 抗体准备

   1) 四只10周龄雌性兔子，一只兔子被注射0.8ml无菌的PBS和FCA(1:1)的油状混合物；两只兔子被注射TS-结合LPH的混合液；另外一只兔子用ts-bsa做**原。老鼠被注射0.5mg的混合液(2*0.2ml)肩胛骨，0.8ml油状混合物臀肌部(2*0.4ml)。兔子接受同样的载体注射，不同的是FIA代替FCA，在**次注射后间隔2到4周。

   2) 在4周后，从兔子耳源大静脉取血，大约每只老鼠15毫升，6周时，通过心脏采血每只兔子大约70毫升，收集的血液室温放置1.5小时，离心血清，1000转，5分钟，出现清亮的黄色的血清和红色的血细胞沉积，血清被收集到1.5ml的密封的容器，保存到-20^oC。

2. 从兔子血清中分离IgG

0.6ml蛋白A填充物被装到10ml的一次性聚丙烯柱中，这个柱子用含0.02%叠蛋化钠的10mlPBS冲洗。已经被滤过的血清0.5ml慢慢从蛋白A柱子的上端缓缓加入，大约停留15分。需15ml含叠氮化合物的PBS去洗脱除IgG的血清蛋白类，大约3分钟。1ml血清蛋白类被收集。接下来，用大约5ml乙酸洗脱IgG。洗脱液被转移到透析袋中 (4L，25mM的碳酸氢铵24h，每4h换液)。这个透析袋中的物质被冷冻干燥，储存在-20^oC。从0.5ml兔子血清可重获 IgG约为2mg。

3. **球蛋白Fab片段的产生

   1) 固定用的木瓜蛋白酶0.5ml被加到一个玻璃检测管中。消化缓冲液(2.76g磷酸二氢钠、3.80g乙二胺四乙酸盐粉防己碱盐和 3.51 g半胱氨酸氢氧化物，1M的氢氧化钠调节PH到7.0)被加到检测管中，木瓜蛋白酶可以经缓冲液酶被分离，重复用消化缓冲液洗脱酶一次。固定用的木瓜酶被悬浮在0.5ml的消化液中。冻干的IgG(4mg)溶解在2ml新鲜的消化液中，加入到经木瓜酶预处理过的检测管里。在37 ^oC摇动水浴中温育酶-IgG混合物5h。5h后，1.5ml 10 mM三氨基甲烷盐酸缓冲液ph7.5，被加到IgG酶消化液中，Fab片段被分离。

   2) Fab片段，不水解的IgG和Fc片段被装到蛋白A填充物的顶部，洗脱柱用10mlPBS，在速度为1 mL/3 min，第1mL被丢弃，接下来的3 mL被收集转移到透析袋中。用4L，25mM的碳酸氢铵24h，每4h换液。这个透析袋中的物质被冷冻干燥，从0.5mL兔子血清中重获1.1 mgFab(通过凝胶等电点聚焦电泳确认Fab是否被纯化)。

4. 间接ELISA，96孔微量滴定

   1) 加入200µL含的20µg/mL(TS-OV，NS-OV，CS-OV)的0.01%的硫柳汞PBS，，4^oC包被过夜，在每个板上放一块湿袋。**天，倒掉包被液，每个孔加入200µL含的1%BSA的硫柳汞的PBS，再放到相同的袋子里，室温1h。倒掉包被液，洗3次板，加入100 µ含0-25µg/mL磺胺药的硫柳汞的PBS。

   2) 稀释血清至0.05%BSA的板被保存在塑料袋中，室温2h，用硫柳汞PBS洗三次。加入稀释3000倍的山羊抗兔子抗体，加入硫柳汞PBS至每孔200µL/well，包括空白组也被保存在塑料袋中，室温2h，用硫柳汞PBS洗三次。

   3) 酶作用底物，0.4 mg/mL(o-phe- nylenediamine)和过氧化铵(1.0mg/mL)，0.1M柠檬酸盐，PH4.75加到每个孔里，200µL/well，在反应30min后，室温条件下，用酶标仪测定吸收率，450nm测定吸收值。