RBSDV 提取方法

RBSDV 提取方法

实验试剂

提取缓冲液Ⅰ（GMT）[ 详细信息：

   Glycine             0.3mol/l

   MgCl₂              0.03mol/l

   Tris-HCl           0.05mol/l  (pH 7.5) ]
 

提取缓冲液Ⅱ(PB)     [ 详细信息：

   Na₂HPO₄           0.1mol/l

   KH₂PO₄            0.1mol/l   (pH 5.8)

pH较低的PB 缓冲液可以稳定完整的病毒粒子，但产量可能有一定的影响。]

实验步骤

1.      取新鲜病叶100g剪成1cm碎片，加350ml提取缓冲液a，搅碎；

2.      用从重纱布过滤；

3.      加TritonX-100至3%（得到的多为较完整的病毒粒子，但产量低；若加四氯化碳至30% TritonX-100至2% 则可获得大量的亚病毒粒子），4℃搅拌1h；

4.      5,000×g离心20 min，4℃;

5.      取液相铺在1/3管体积的40%的蔗糖垫上，40,000×g 离心1.5h，4℃；

6.      用2ml缓冲液悬浮沉淀；

7.      3,500×g离心5min；

8.      上清用缓冲液稀释后40,000×g，1.5h，4℃，浓缩，悬浮后可以得到病毒的粗提物，若要获得比较纯的病毒提取物则铺在20%-50%的蔗糖密度梯度上，80,000×g离心1.5h，4℃；

9.      自上而下依次取每管2ml离心后的溶液，电镜观察，含病毒量高的管用缓冲液稀释后40,000×g，1.5h，4℃浓缩，适量缓冲液悬浮。

注意事项

由于病毒粒子主要存在于微管束内，以韧皮部居多，所以可将缓冲液体积降低到1/10然后用绞肉机搅碎。