Folin法测定蛋白含量:
1、用品和仪器:分光光度剂,试管及试管架,微量自动取液仪(20,100,200,1000UL)。
2、试剂:
试剂甲:贮液A(4g/100mlNa2CO3),贮液B(0.2mol/100lNaOH),贮液C(1g/100mlCuSO4.5H2O),贮液D(2g/100ml 酒石酸钾钠)临用前将A和B等体积混合为碳酸钠-氢氧-化钠溶液,C与D混合盛Folin-酚试剂甲,1天内有效。
试剂乙:取乌酸钠100G,目酸钠25G,置于2000ml膜口回流装置内,加蒸馏水700ml,85%磷酸50ml和浓盐酸100ml,充分混匀,使其溶解。小火加热,回流10小时(烧瓶中加入玻璃珠以防溶液外溅)再加入硫酸锂150g蒸馏水50ml及液-溴数滴,在通风厨开口煮沸15分钟,以除去多余的溴,冷却后定容与1000ml,过滤即成Folin-酚试剂乙贮存液,颜色为鲜黄色,置于棕色瓶中,可在冰箱长期保存,颜色变绿,在加几滴溴,煮沸数分钟,恢复原色试剂乙在使用前应该确定其酸度,使之滴定标准氢氧-化钠试剂(1mol/l),以酚酞为指示剂,当溶液颜色由红-紫红-紫灰-墨绿即可为终点,酸度为2MOL/L将其稀释到1mo/l即可。
标准蛋白质溶液:精 确称取结晶牛血清蛋白3mg溶于双证水中,定容于10ML,浓度为0.3mg/ml。
实验方法:1.取16mm*150mm试管13支,标明号码,放置与试管架,在1-11号试管中分别加入标准牛蛋白血清(0.3mg/ml)0,0.1,0.2--------1.0ml,补足双蒸水至每管体积1.0ml,在12,13管中加入待测样品100UL,并补足双蒸水至1.0ml。
3、加入5.0ml新配置的试剂甲,立即混匀,在室温下放置10分钟。
4、各管中加入0.5ml试剂乙,充分混匀,(用振荡器),然后室温放置30-60min。
5、将标准样及待测样品在可见光光度计上比色,如果蛋白含量低于500UG/ML,在750nm下比色,如果在100ug/ml之内,则在550nm波长下比色。
6、根据已知含量的标准样品测得的光吸收值做标准曲线,然后根据待测样品的光吸收值在标准曲线上查出蛋白含量。