RAPA3G Probe qPCR MasterMix(with UDG)

商品属性：

储存条件：

RAPA3G Probe qPCR MasterMix(with UDG)储存：-20℃可保存 2 年。短期使用可放置 2-8℃，保存 3 个月。如出现白色沉淀溶解后使用，不影响反应性能。该试剂经 30 次冻融后性能无下降，因此不使用时请置于-20℃避光保存。

产品介绍：

 RAPA3G Probe qPCR MasterMix 将热启动 RAPA3GDNA 聚合酶、反应 Buffer、dNTP 染料等试剂预混在一起，是一种 2×浓度的单组分预混试剂。该制品不含有 ROX 校正染料，适用于各种荧光标记探针，并且适用于各种定量 PCR机型。优化的反应缓冲液，使得该制品可用于单重及多重的探针法定量 PCR。制品中的 RAPA3G DNA 聚合酶为第三代 DNA 聚合酶，其具有*高的杂质耐受性，其对乙醇、胍盐、肝素、血清、植物多糖多酚具有极高的耐受性，因此可用于粗样品的直接定量 PCR 检测(Direct PCR)。该酶经化学法修饰，在 50℃以下 100%无活性，只有 95 度条件下加热 5min 后才能完全恢复酶的活力。因此该系统可以有效抑制非特异性 PCR 扩增，极大的提高了 PCR 扩增特异性。由于 RAPA3G DNA 聚合酶对 dUTP 具有极强的识别能力，该制品中的 dTTP 核酸碱基完全被 dUTP 所取代，因此扩增产物均包含 dUTP，在配合热敏 UDG（该酶在 95℃热变性 5min 后不可逆失活，不影响后续 PCR 反应）的条件下能达到*佳的防污染能力。在 10e5 copies 污染物的测试条件下，Ct 推迟 15 个以上（污染去除能力>99.997%）。

操作方法：

1、按照如下组分配制 20 μl PCR 反应体系：
终浓度
2×RAPA3G Probe MasterMix(with UDG) 10 μl 1×
Primer F1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM
Primer R1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM
Probe1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM
其它引物和探针 X
DNA 模板 0.5~2 μl
ddH2O Up to 20 μl
2. 进行 Real-Time PCR 反应,通常采用两步法，程序如下：
Stage 1 25℃ 2 min 去污染
Stage 2 95℃ 5 min 热启动
Stage 3
40 循环
95℃ 5 s 变性
60℃ 30 s 收集信号 退火/延伸
注意：退火延伸温度可在 55-65℃调整
3. 在多数情况下，采用两步法程序可获得理想的扩增效果，在无法达到预期理想效果的情况下，也可采用三步法 PCR程序，程序如下：
Stage 1 25℃ 2 min 去污染
Stage 2 95℃ 5 min 热启动
Stage 3
40 循环
95℃ 5 s 变性
55℃ 10 s 退火
72℃ 30 s 收集信号 延伸
4. 反应结束后确认 Real-Time PCR 的扩增曲线和标准曲线。
注意：消化污染步骤中的温度设置可在 25-37℃之间均可，无显著差异，但高于 42℃以上的温度会导致热敏 UDG 消化能力急剧下降。

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