高效液相色谱仪测定食品中合成着色剂含量
1 范围
本标准规定了饮料、配制酒、硬糖、蜜饯、淀粉软糖、巧克力豆及着色糖衣制品中合成着色剂(不含铝色锭)的测定方法。
本标准适用于饮料、配制酒、硬糖、蜜饯、淀粉软糖、巧克力豆及着色糖衣制品中合成着色剂(不含铝色锭)的测定。
2 原理
食品中人工合成着色剂用聚酰胺吸附法或液 - 液分配法提取,制成水溶液,注入高效液相色谱仪,经反相色谱分离,根据保留时间定性和与峰面积比较进行定量。
3 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为 GB / T6682 规定的上等水。
3. 1 试剂
3. 1. 1 甲醇( CH 3 OH ):色谱纯。
3. 1. 2 正己烷( C 6 H 14 )。
3. 1. 3 盐酸( HCl )。
3. 1. 4 冰醋酸( CH 3 COOH )。
3. 1. 5 甲酸( HCOOH )。
3. 1. 6 乙酸铵( CH 3 COONH 4 )。
3. 1. 7 柠檬酸( C 6 H 8 O 7 · H 2 O )。
3. 1. 8 硫酸钠( Na 2 SO 4 )。
3. 1. 9 正丁醇( C 4 H 10 O )。
3. 1. 10 三正辛胺( C 24 H 51 N )。
3. 1. 11 无水乙醇( CH 3 CH 2 OH )。
3. 1. 12 氨水( NH 3 · H 2 O ):含量 20%~25% 。
3. 1. 13 聚酰胺粉(尼龙 6 ):过 200 μ m (目)筛。
3. 2 试剂配制
3. 2. 1 乙酸铵溶液( 0. 02mol/ L ):称取 1.54g 乙酸铵,加水至 1000mL ,溶解,经 0.45 μ m 微孔滤膜过滤。
3. 2. 2 氨水溶液:量取氨水 2mL ,加水至 100mL ,混匀。
3. 2. 3 甲醇 - 甲酸溶液( 6+4 ,体积比):量取甲醇 60mL ,甲酸 40mL ,混匀。
3. 2. 4 柠檬酸溶液:称取 20g 柠檬酸,加水至 100mL ,溶解混匀。
3. 2. 5 无水乙醇 - 氨水 - 水溶液( 7+2+1 ,体积比):量取无水乙醇 70mL 、氨水溶液( 3. 2. 2 ) 20mL 、水10mL ,混匀。
3. 2. 6 三正辛胺 - 正丁醇溶液( 5% ):量取三正辛胺 5mL ,加正丁醇至 100mL ,混匀。
3. 2. 7 饱和硫酸钠溶液。
3. 2. 8 pH6 的水:水加柠檬酸溶液调pH到 6 。
3. 2. 9 pH4 的水:水加柠檬酸溶液调pH到 4 。
3. 3 标准品
3. 3. 1 柠檬黄( CAS : 1934-21-0 )。
3. 3. 2 新红( CAS : 220658-76-4 )。
3. 3. 3 苋菜红( CAS : 915-67-3 )。
3. 3. 4 胭脂红( CAS : 2611-82-7 )。
3. 3. 5 日落黄( CAS : 2783-94-0 )。
3. 3. 6 亮蓝( CAS : 3844-45-9 )。
3. 3. 7 赤藓红( CAS : 16423-68-0 )。
3. 4 标准溶液配制
3. 4. 1 合成着色剂标准贮备液( 1mg / mL ):准确称取按其纯度折算为 100% 质量的柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、赤藓红、亮蓝各 0.1g (准确至 0.0001g ),置 100mL 容量瓶中,加pH6 的水到刻度。配成水溶液(1. 00mg / mL )。
3. 4. 2 合成着色剂标准使用液( 50 μ g / mL ):临用时将标准贮备液加水稀释 20 倍,经 0. 45 μ m 微孔滤膜过滤。配成每毫升相当 50.0 μ g 的合成着色剂。
4 仪器和设备
4. 1 高效液相色谱仪,带二极管阵列或紫外检测器。
4. 2 天平:感量为 0. 001g 和 0. 0001g 。
4. 3 恒温水浴锅。
4. 4 G3 垂融漏斗。
5 分析步骤
5. 1 试样制备
5. 1. 1 果汁饮料及果汁、果味碳酸饮料等:称取 20g~40g (准确至 0. 001g ),放入 100mL 烧杯中。含二氧化碳样品加热或超声驱除二氧化碳。
5. 1. 2 配制酒类:称取 20g~40g (准确至 0. 001g ),放入 100mL 烧杯中,加小碎瓷片数片,加热驱除乙醇。
5. 1. 3 硬糖、蜜饯类、淀粉软糖等:称取 5g~10g (准确至 0. 001g )粉碎样品,放入 100mL 小烧杯中,加水 30mL ,温热溶解,若样品溶液pH较高,用柠檬酸溶液调pH到 6 左右。
5. 1. 4 巧克力豆及着色糖衣制品:称取 5g~10g (准确至 0. 001g ),放入 100mL 小烧杯中,用水反复洗涤色素,到巧克力豆无色素为止,合并色素漂洗液为样品溶液。
5. 2 色素提取
5. 2. 1 聚酰胺吸附法:样品溶液加柠檬酸溶液调pH到 6 ,加热至 60℃ ,将 1g 聚酰胺粉加少许水调成粥状,倒入样品溶液中,搅拌片刻,以 G3 垂融漏斗抽滤,用 60℃ pH 为 4 的水洗涤 3 次 ~5 次,然后用甲醇 - 甲酸混合溶液洗涤 3 次 ~5 次 (含赤藓红的样品用 5.2. 2 法处理),再用水洗至中性,用乙醇 - 氨水 -水混合溶液解吸 3 次 ~5 次,直至色素完全解吸,收集解吸液,加乙酸中和,蒸发至近干,加水溶解,定容至 5mL 。经 0.45 μ m 微孔滤膜过滤,进高效液相色谱仪分析。
5. 2. 2 液 - 液分配法(适用于含赤藓红的样品):将制备好的样品溶液放入分液漏斗中,加 2mL 盐酸、三正辛胺 - 正丁醇溶液( 5% ) 10mL~20mL ,振摇提取,分取有机相,重复提取,直至有机相无色,合并有机相,用饱和硫酸钠溶液洗 2 次,每次 10mL ,分取有机相,放蒸发皿中,水浴加热浓缩至 10mL ,转移至分液漏斗中,加 10mL 正己烷,混匀,加氨水溶液提取 2 次 ~3 次,每次 5mL ,合并氨水溶液层(含水溶性酸性色素),用正己烷洗 2 次,氨水层加乙酸调成中性,水浴加热蒸发至近干,加水定容至 5mL 。经0. 45 μ m 微孔滤膜过滤,进高效液相色谱仪分析。
5. 3 仪器参考条件
5. 3. 1 色谱柱: C 18 柱, 4. 6mm×250mm , 5 μ m 。
5. 3. 2 进样量: 10 μ L 。
5. 3. 3 柱温: 35℃ 。
5. 3. 4 二极管阵列检测器波长范围: 400nm~800nm ,或紫外检测器检测波长: 254nm 。
5. 3. 5 梯度洗脱表见表 1 。
5. 4 测定
将样品提取液和合成着色剂标准使用液分别注入高效液相色谱仪,根据保留时间定性,外标峰面积法定量。
6 分析结果的表述
试样中着色剂含量按式(1 )计算:
…………………………( 1 )
式中:
X ———试样中着色剂的含量,单位为克每千克( g /kg);
c———进样液中着色剂的浓度,单位为微克每毫升(μ g/ mL );
V———试样稀释总体积,单位为毫升( mL );
m———试样质量,单位为克(g );
1000 ———换算系数。
高效液相色谱仪测定食品中合成着色剂含量
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