高效液相色谱仪测定食品中苏丹红染料的含量
1、范围
本标准适用于食品中苏丹红染料的检测。
本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ的高效液相色谱仪测定方法。
方法*低检测限：苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ均为 10 ug/ kg 。
2、术语和定义
苏丹红：属偶氮系列化工合成染料。
3、方法要点
样品经溶剂提取、固相萃取净化后，用反相高效液相色谱仪—紫外可见光检测器进行色谱分析，采用外标法定量。
4、试剂与标准品
4. 1 乙腈 色谱纯
4. 2 丙酮 色谱纯、分析纯
4. 3 甲酸 分析纯
4. 4 乙醚 分析纯
4. 5 正己烷 分析纯
4. 6 无水硫酸钠 分析纯
4. 7 层析柱管：1cm（内径）× 5cm(高)的注射器管。
4. 8 层析用氧化铝（中性 100 目～200 目）： 105℃ 干燥 2h，于干燥器中冷至室温，每 100g 中加入 2mL水降活，混匀后密封，放置 12h后使用。
4. 9 氧化铝层析柱：在层析柱管底部塞入一薄层脱脂棉，干法装入处理过的氧化铝至 3 cm 高，轻敲实后加一薄层脱脂棉，用 10mL正己烷预淋洗，洗净柱中杂质后，备用。
4. 10 5%丙酮的正己烷液：吸取 50mL 丙酮用正己烷定容至 1L。
4. 11 标准物质：苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ；纯度≥95%
4. 12 标准贮备液：分别称取苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ及苏丹红Ⅳ各 10. 0mg（按实际含量折算），用乙醚溶解后用正己烷定容至 250mL。
5、仪器与设备
5. 1 高效液相色谱仪（ 配有紫外可见光检测器）
5. 2 分析天平：感量 0.1mg
5. 3 旋转蒸发仪
5. 4 均质机
5. 5 离心机
5. 6 0.45μm有机滤膜
6、样品制备
将液体、浆状样品混合均匀，固体样品需磨细。
7、操作方法
7. 1 样品处理
7. 1. 1 红辣椒粉等粉状样品
称取1 g～5g（准确至0. 001g）样品于三角瓶中，加入10mL～30mL正己烷，超声5mi n，过滤，用10mL正己烷洗涤残渣数次，至洗出液无色，合并正己烷液。
用旋转蒸发仪浓缩至5mL以下，慢慢加入氧化铝层析柱中，为保证层析效果，在柱中保持正己烷液面为2mm左右时上样，在全程的层析过程中不应使柱干涸，用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶，一并注入层析柱。
控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于0. 5cm，待样液完全流出后，视样品中含油类杂质的多少用10mL～30mL正己烷洗柱，直至流出液无色，弃去全部正己烷淋洗液，用含5%丙酮的正己烷60mL洗脱，收集、浓缩后，用丙酮转移并定容至5mL，经0. 45μm有机滤膜过滤后待测。
7. 1. 2 红辣椒油、火锅料、奶油等油状样品
称取0. 5 g～2g（准确至0. 001g）样品于小烧杯中，加入适量正己烷溶解（约1 mL～10mL），难溶解的样品可于正己烷中加温溶解。按7. 1. 1中“慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测”操作。
7. 1. 3 辣椒酱、番茄沙司等含水量较大的样品
称取10 g～20g（准确至0. 01g）样品于离心管中，加10mL～20mL水将其分散成糊状，含增稠剂的样品多加水，加入30mL正己烷：丙酮 = 3：1，匀浆5mi n, 3000rpm离心10mi n, 吸出正己烷层，于下层再加入20mL×2次正己烷匀浆，离心，合并3次正己烷，加入无水硫酸钠5g 脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持5分钟，用5mL正己烷溶解残渣后，按7. 1. 1中“慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测”操作。
7. 1. 4 香肠等肉制品
称取粉碎样品10g～20g（准确至0. 01g）于三角瓶中，加入60mL正己烷充分匀浆5mi n，滤出清液，再以20mL×2次正己烷匀浆，过滤。合并3次滤液，加入5g无水硫酸钠脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸至5mL以下，按7. 1. 1中“慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测”操作。
7. 2 推荐色谱条件
7. 2. 1 仪器条件
色谱柱： C18 3.5 μm 4. 6mm×150mm
流动相：
A：0.1%甲酸的水溶液：乙腈 = 85：15
B ：0.1%甲酸的乙腈溶液：丙酮=80：20
梯度洗脱：
流速:1mL/min
柱温：30℃
检测波长：苏丹红Ⅰ 478nm ；苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ 520nm ；于苏丹红Ⅰ出峰后切换。
进样量 10μl 。
7. 2. 2 标准曲线
吸取标准储备液0、0. 1、0. 2、0. 4、0. 8、1. 6mL ，用正己烷定容至25mL，此标准系列浓度为0、0. 16、0. 32、0. 64、1. 28、2. 56μg/ mL, 绘制标准曲线。
7. 3 计算
按公式（1）计算苏丹红含量
R=C × V / M ······（1）
R —样品中苏丹红含量，单位为毫克每千克（mg/ kg）；
C —由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度，单位为微克每毫升(μg/ mL)；
V —样液定容体积，单位为毫升（mL）；
M —样品质量，单位为克（g）
高效液相色谱仪测定食品中苏丹红染料的含量
高效液相色谱仪测定食品中苏丹红染料的含量
高效液相色谱仪测定食品中苏丹红染料的含量
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